从云南红豆杉细胞培养物中分离鉴定10-去乙酰巴卡亭Ⅲ

目的：从云南红豆杉（Taxus yunnanensis）细胞培养物中提取、分离和纯化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatinm,10-DABⅢ）。方法：采用固液分离、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、重结晶等方法从细胞培养物中提取分离得到10-DABⅢ,并用波谱解析（1HNMR,13CNMR）对其结构进行了鉴定。结果：建立了从红豆杉细胞培养物中提取、分离和纯化10-DABⅢ的方法,证明与从天然红豆杉植物中得到的10—DABⅢ为同一化合物。结论：本方法简便、成本低,可用于红豆杉细胞培养物中10-DABⅢ的提取、分离。     

红豆杉中巴卡亭类化合物的ESI/MS及APCI/MS比较研究

采用分析型反相高效液相色谱和两种大气压电离质谱联用技术(LC／API／MS)：电喷雾电离质谱(ESI／MS)和大气压化学电离质谱(APCI/MS),研究了红豆杉中含有的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅳ、1-去羟基巴卡亭Ⅳ、1-去羟基巴卡亭Ⅵ等巴卡亭类化合物的质谱特征．这些化合物在APCI正离子全范围扫描中主要形成[M H3O]^ ,在ESI正离子全范围扫描中主要形成[M Na]^ 离子,同时都会产生与结构相关的碎片离子．另外还研究了这些化合物相对质谱信号强度和相对色谱保留时间之间的关系,发现在ESI中,两者之间有很好的线性关系,而在APCI有相同的变化趋势．     

南方红豆杉内生菌及紫杉烷类产物的初步鉴定

从南方红豆杉（Ｔａｘｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒｍａｉｒｅｉ）的主干和侧枝树皮及皮下部分,分离、筛选得到９１个纯化的微生物菌株．经过摇瓶培养和静止培养,再用二氯甲烷萃取抽提,抽提产物经以ｔａｘｏｌ、ｂａｃｃａｔｉｎⅢ和ｃｅｐｈａｌｏｍａｎｎｉｎｅ为标准对照的薄层层析分析,表明其中６个菌株能分泌紫杉烷类的化合物．分类鉴定的初步结果为头孢霉属、轮柄梳霉属和无孢菌群等     

诱导促进中国红豆杉细胞培养中紫杉烷的积累

通过甲苯莉酮酸酯（MJA）或二氢甲基苯莉酮酸酯（HMJA）的诱导，有效增强了中国红豆杉（Taxus chinensis）悬浮细胞培养中新型生理活性物质云南紫杉烷（taxuyunnanine C,Tc）的积累。在培养第7天添加500μmol/L MJA后，产物的胞内最大含量为每克干细胞含29.5ng Tc，但细胞生长受到明显抑制；在添加100μmol/LMJA时，Tc的总产量达最大，为300mg/L。紫杉烷生物合成途径中的关键酶紫杉二烯合成酶的活力在被诱导后也获得大幅度提高。     

稀土诱导子对红豆杉细胞生长及产生10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的影响

目的:研究稀土诱导子对云南红豆杉细胞生长及产生10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的影响.方法:在培养12d后分别向培养基中添加不同浓度的硝酸铈、硝酸铈铵和硝酸镧诱导子,经过培养对云南红豆杉细胞生长量进行统计,用HPLC法测定细胞中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量.结果:培养基中添加0.1mmol/L硝酸铈、0.01mmol/L硝酸铈铵和0.01mmol/L的硝酸镧时,10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量是不添加时的2.3倍、4.1倍和2.6倍,含量分别为0.05446%、0.09767%和0.061 87%.结论:该研究为云南红豆杉细胞培养生产10-去乙酰巴卡亭Ⅲ提供理论依据.     

高效液相色谱法测定云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的含量

目的：建立云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量的测定方法。方法：样品经干燥研细后采用甲醇浸提、乙酸乙酯萃取,测定同一批细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量,采用Spherisorb C185μm柱,流动相甲醇-乙腈-水（42∶13∶45）,流速1.0ml/min,检测波长为234nm。结果：云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量为0.023 47%,平均回收率为100.6%,变异系数（RSD）为2.2%。结论：该方法能准确、快速测定云南红豆杉细胞培养物中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量,为探讨10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ在细胞培养物中的代谢研究提供测定方法。     

南方红豆杉悬浮培养细胞中糖代谢的波动性及其与紫杉烷合成关系的研究

针对悬浮培养南方红豆杉细胞利用不同浓度的蔗糖进行了研究,通过检测细胞内外的蔗糖,果糖和葡萄糖以及胞内淀粉含量的变化,发现细胞团体系中碳素代谢是以胞内淀粉变化为核心的,蔗糖,葡萄和果糖的消耗和吸收呈现波动性,从而促进使细胞生物量的增国和紫杉烷类化合物的合成,同时研究发现细胞对蔗糖的消耗有一个临界点,即培养液中有1mg/mL的蔗糖不能被吸收,而培养液中浓度为3％的蔗糖对细胞攻产物合成最为有利,蔗糖大部分被降解成葡萄糖和果糖,其中葡萄糖有利于细胞的前期生长以获得大量的生物量,果糖在中期添加有利于细胞培养后期合成紫杉烷类化合物,其中紫杉醇并不是次生代谢途径的最终产物。     

一种新型的紫杉烷生物素共轭物的制备

生物素与肿瘤细胞表面的生物素受体结合,通过受体介导的内吞作用将共轭物摄入细胞内,二硫键在肿瘤细胞中能够开链,释放出活性物质,实现靶向性给药,从而大大降低传统化疗药物因缺乏对肿瘤细胞的选择性而引起的毒副作用。用巯基置换的方式,合成含有二硫键的连接链;用将羧酸基团转化为酰肼基团的方法,将生物素转化为生物素酰肼;选用具有抗多药耐药性的含氟紫杉烷SB-T-12854作为细胞毒分子;通过含有二硫键的连接链将含氟紫杉烷化合物SB-T-12854与生物素酰肼进行偶连,形成一种新型的紫杉烷生物素共轭物。     

紫杉烷类PEG-PDLLA纳米粒的制备及其体外评价

采用乳化-溶剂蒸发法制备紫杉烷类PEG-PDLLA纳米粒,马尔文激光粒度仪测其粒径及Zeta电位;HPLC法测定纳米粒包封率和载药量;研究载药纳米粒在PBS中的释放动力学;初步评价载药纳米粒在MGC803、HeLa细胞中的摄取及细胞毒性。结果表明,通过包载形成的纳米粒的粒径为(13±1)nm,分布较集中。载体与药物的质量比在20∶1时,紫杉醇的均一性最好,卡巴他赛的包封率最高,达到88.77%。载药纳米粒具有较好的缓释作用,MGC803、HeLa细胞的存活率降低,与临床用注射剂效果相近。紫杉烷类PEG-PDLLA纳米粒的性质、释放、细胞抑瘤率都较好,可为开发紫杉烷类新型静脉注射制剂提供实验依据。     

南方红豆杉紫杉烷7β-羟基化酶基因全长序列的克隆和进化分析

 从南方红豆杉Taxus wallichiana var.mairei的新鲜嫩叶中提取基因组DNA作为模板,利用三组特异引物进行PCR扩增,然后克隆测序得到紫杉烷7β-羟基化酶的基因全长。该基因编码区起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,全长1 692 bp;碱基组成为490 A (29.0%),351 C (20.7%),362 G (21.4%)和489 T (28.9%)。将紫杉烷7β-羟基化酶基因全长序列与细胞色素P450基因家族的其它三个成员进行比对,发现它与紫杉烷2α-羟基化酶基因、紫杉烷10β-羟基化酶基因及紫杉烷13α-羟基化酶基因的一致性分别为74%、68%及76%。它们的外显子和内含子的连接区均具保守的GT-AG结构,内含子区的变异性明显高于外显子区。进一步以红豆杉属的13个紫杉烷羟基化酶基因家族成员为对象,利用位点间可变ω(非同义替换率dN和同义替换率dS的比值) 模型对该基因家族的适应性进化进行分析。分支模型、位点模型以及分支－位点模型的分析表明：紫杉烷羟基化酶基因家族的少数分支处于正选择压力下(ω>1),但未检测到正选择位点;而绝大部分位点受强烈的负选择作用(ω<1)。     

人工栽培南方红豆杉紫杉烷成分的研究

采用溶剂萃取及多种色谱技术分离纯化,从人工栽培南方红豆杉中分离得到紫杉醇(Ⅰ)、2′-乙酰氧基-7-表-紫杉醇(Ⅱ)、(3E,7E)-2,α10,β13α-三乙酰基-5,α20-二羟基-3,8-断紫杉烷-3,7,11-三烯-9-酮(Ⅲ)和7-表-紫杉醇(Ⅳ),其中化合物(Ⅱ)首次从南方红豆杉分离得到。     

3-羰基-10-去甲基-12-甲氧基松香烷的全合成

按照AC-ABC的合成策略,设计了1种新的合成路线,并合成了目标产物3-羰基-10-去甲基-12-羟基松香烷.在合成中,以2-异丙基苯甲醚为原料,在磷钼酸铵催化下,经过对位溴代、与环氧乙烷加成和节醇溴代等反应步骤,合成了3-羰基-10-去甲基-12-甲氧基松香烷13,总收率达14.17%.通过红外光谱、核磁共振谱和质谱等结构表征,结果表明成功实现了目标产物的全合成.     

响应面法优化南方红豆杉中10-DAB提取工艺及其含量测定

为探究南方红豆杉（Taxus wallichiana var.mairei）中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DAB）的最佳提取工艺,本研究以南方红豆杉中10-DAB含量为指标,以料液比、提取时间及超声温度为考察因素,采用单因素试验结合响应面法优化10-DAB的提取工艺,并采用超高效液相色谱（UPLC）法检测不同采摘部位、不同生长年限及不同采收时节的10-DAB含量差异。结果表明,南方红豆杉中10-DAB的最佳提取工艺条件为料液比1∶15（g/mL）、提取时间23 min、超声温度40℃,该工艺条件下10-DAB的含量为1.18%,与理论值相对偏差为0.42%。UPLC检测结果表明,南方红豆杉叶的10-DAB含量显著高于枝和树皮,且10-DAB全年累积含量受季节影响明显,10月份达到最高值。该研究可为南方红豆杉中10-DAB的提取利用提供参考依据。     

超临界CO2-混合夹带剂萃取法提取10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ工艺条件研究

目的：以南方红豆杉的枝叶为原料,研究其活性成分10-脱乙酰巴卡丁Ⅲ（10—DABⅢ）提取的最佳工艺条件。方法：运用正交试验法研究萃取温度、萃取压力、萃取时间、混合夹带剂用量对CO2超临界萃取10-DABⅢ的影响。结果：最佳工艺条件为：夹带剂用量为15ml,萃取温度为50℃,压力为25MPa,时间在180min。各因素影响的强烈程度为夹带剂用量〉萃取温度〉压力〉时间。用最佳工艺条件从南方红豆杉枝叶中提取10-DABⅢ的平均量为0．600g／kg。     

7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱的HPLC分析方法及其溴化产物的抗癌活性研究

分别在C18柱和Metachem Taxsii-3紫杉醇专用柱上研究了云南红豆杉粗提物中紫杉醇(1)、三尖杉宁碱(2)、7-表-10-去乙酰基紫杉醇(3)和7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱(4)的反相色谱行为．在Metachem Taxsil-3紫杉醇专用柱上,水：乙腈(54:46)的流动相使这四种色谱行为相近的化合物获得了基线分离．使用溴化法处理含有(2)和(4)的红豆杉粗提物,通过分离纯化得到了二溴-7-表-10-去乙酰基三尖杉宁碱的两个非对映异构体(5和6)．体外活性实验结果表明,5和6对于人乳腺癌(MCF-7)、人肺癌(A549)和人卵巢癌的体外毒性比紫杉醇略强．