链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶（MTG）在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成重组质粒,然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,经测序证明为目的基因片段.结果表明：经过PCR和酶切均证明已经将目的片段转到酵母表达载体pPIC3.5k内.     

重组人细胞色素P450 2C9在毕赤酵母中的胞内表达

以含有CYP2C9基因完全编码框的克隆载体质粒DNA为模板,并在人细胞色素P4502C9的5’端插入kozak序列及3’端6×His标签进行PCR扩增,克隆至真核表达载体pPIC3.5K,利用电激法将经Sal I线性化的重组质粒pPIC3.5K-2C9转化至毕赤酵母GS115中,通过抗性、表型和PCR筛选多拷贝整合株,甲醇诱导毕赤酵母GS115/pPIC3.5K-2C9的表达,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物.结果表明:含有重组质粒的重组pPIC3.5K-2C9表达了大小为55KD的目的蛋白,与预期大小相符,说明人细胞色素CYP2C9可在毕赤酵母的胞内表达.     

扩展青霉FS1884脂肪酶基因的定点诱变及其活性分析

为提高扩展青霉FS1884脂肪酶活性,采用一步突变法对脂肪酶(PEL)的基因进行体外M220V定点诱变,然后将其连接到表达载体pPIC3.5K中, 构建重组表达载体pPIC3.5K-M220V-PEL,电转化毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导后脂肪酶成功分泌表达.重组脂肪酶的活性分析表明:突变体在毕赤酵母中得到活性表达,获得脂肪酶表达产物PEL-M220V-GS,在35 ℃下具有最高酶活为3 099 U/mg, 比野生型提高了5%.     

猪胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的表达

利用已有的猪胃蛋白酶原AcDNA,构建毕赤酵母pPIC3.5K-pA胞内表达载体.经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得两株高表达的重组子,研究它们在不同pH值、不同诱导时间、不同起始浓度和不同甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低.结果表明:在pH值为7、诱导72h、起始诱导浓度的OD600为2、甲醇诱导浓度为1%时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6.46U/mL.     

人载脂蛋白基因apoAⅠ在毕赤氏酵母中的胞内表达

将PCR扩增得到的apoAⅠ基因片段插入胞内表达质粒pPIC3.5K,重组的pPIC3.5K apoAⅠ用BglⅡ酶切后,转化PichiapastorisGS115菌株,筛选获得G418高抗性转化子,再通过PCR鉴定证实apoAⅠ基因已整合到染色体上.其转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导,收集细胞裂解后,用SDS PAGE与Westernblotting检测,证明胞内有明显的rApoAⅠ表达,其分子质量与人血浆提取的ApoAⅠ相同.     

少根根霉△12-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

为探讨采用转基因的方法将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸菌株的可行性,将来自于丝状真菌少根根霉的△12-脂肪酸脱氢酶基因与毕赤酵母的胞内表达载体pPIC3.5K连接构建了重组表达载体pPICRAD12,经Sac I线性化后电击转化毕赤酵母菌株GS115获得转基因酵母菌株PICRAD12.PCR鉴定结果表明,目的基因已经整合到毕赤酵母基因组中.经甲醇诱导表达后,通过气相色谱和气相色谱和质谱连用的方法分析转基因毕赤酵母的脂肪酸成分表明,转基因毕赤酵母的亚油酸含量增加了4.5%,说明了可以通过增加△12-脂肪酸脱氢酶基因的拷贝数或者使用强启动子的方法来增加亚油酸的含量,为将毕赤酵母改造为产多不饱和脂肪酸的基因工程菌株进行了有意义的探索.     

葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高效分泌表达

为了获得高效分泌表达葡萄糖氧化酶(GOD)的毕赤酵母,采用黑曲霉来源的GOD基因序列,按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化,构建AOX1启动子诱导的分泌表达载体pPIC9K-GOD和重组菌G/GOD,通过提高遗传霉素G418浓度筛选到第1代高拷贝高产量重组菌G/GODM,单位细胞干重胞外产酶水平可达5843.2 U/g,...     

红色荧光蛋白在毕赤酵母中的高效表达

报道了红色荧光蛋白(DsRFP)在毕赤酵母中的高水平表达．利用PCR技术从YEpFLAG-1-DsRFP扩增出DsRFP编码序列．克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3．5K构建重组表达载体pPIC3．5K-DsRFP．电击转化进毕赤酵母．G418-RDB平板双重筛选后获得重组转化子．经MM／MD平板培养与PCR鉴定．重组子全部为HIS^ -MUT^ 表型．重组菌株诱导表达48h后获得了高效表达．摇瓶中表达水平达到细胞内总蛋白的12％．表达量达到1．8g／L．经硫酸铵分级沉淀，DE-AE-5PW阴离子交换柱层析与S-HyperD阳离子交换柱层析后获得电泳纯蛋白．说明我们建立的毕赤酵母表达应用平台具有高效表达外源蛋白的能力。     

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸延长酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

长链多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA,C20:4n-6)是合成生物活性物质类二十碳烷酸的初级底物神经组织的重要组成成分.Δ6-脂肪酸延长酶是花生四烯酸Δ6-合成途径的关键酶之一.根据已经报道的Δ6-脂酸延长酶基因序列设计引物,分别从产花生四烯酸的丝状真菌高山被孢霉ATCC16266菌株基因组和cDNA扩增得到该序列.经序列分析后,将来源于cDNA的序列连接到毕赤酵母表达载体pPIC3.5K上,得到重组质PIC3.5K-ELO.用电击转化法将重组载体pPIC3.5K-ELO转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,在缺省培养基筛选得到毕赤酵母转化菌株pPIC3.5K-ELO.在适宜的培养条件下,添加外源底物γ-亚麻酸(GLA)和诱导物醇诱导基因表达.气相色谱分析表明该基因在毕赤酵母中得到了表达,底物GLA转化为二高γ-亚麻酸GLA),转化效率为28.91%.对Δ6-脂肪酸延长酶进行跨膜分析,表明该蛋白为具有7个跨膜域的膜结合蛋白.     

表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒pPIC9K中,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P.pastorisGS115。筛选出整合型His⁺Mut^s 菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究,结果表明外源基因在毕赤酵母中很稳定.