全骨髓贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞

为体外建立一种高效、稳定的从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞的方法。采用全骨髓贴壁法分离C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,传至第三代后运用流式细胞术检测第三代细胞的表面抗原;取第三代细胞,分别向成骨、成软骨诱导分化。结果显示:流式细胞术检测CD29、Scal-1、CD45的阳性率分别为97.1%、87.1%、0.7%;在成骨培养基的诱导下,碱性磷酸酶染色、茜素红染色均呈阳性;在成软骨培养基的诱导下,阿利辛蓝染色阳性。由此可知,通过此方法可以获得较高纯度的小鼠骨髓间充质干细胞,并且具有多向分化潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养方法的建立

为建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养的方法,为后续细胞共培养奠定实验基础。采用通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞的方法,进行形态学观察,并应用流式细胞术检测BMSCs免疫学表型,对其进行鉴定;将获得的第三代BMSCs向脂肪细胞和成骨细胞方向进行诱导分化,诱导21 d后的脂肪细胞应用油红O染色进行鉴定,成骨细胞应用茜素红染色进行鉴定;将获取的骨髓细胞液按照造血系单核干细胞诱导培养法向破骨细胞方向进行诱导分化,于28 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色进行鉴定。结果显示,BMSCs体外培养14 d具有独特的细胞免疫学表型,流式细胞术检测,CD29+、CD44+表达量分别为97.92%和89.32%;在脂肪培养基诱导下,油红O染色阳性。在成骨培养基诱导下,茜素红染色阳性;骨髓细胞液在破骨培养基诱导下,抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性。由此可知,建立了稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞诱导分化的培养方法。     

长白猪骨髓和脂肪间充质干细胞复制性衰老过程中生物学特性和抗氧化损伤能力的比较

为研究对比长白猪骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)和脂肪间充质干细胞(adiposederivedmesenchymalstemcells,AMSCs)在体外衰老过程中的生物学特性和抗氧化损伤能力,分别利用贴壁筛选法、Ⅰ型胶原酶消化法分离获得BMSCs和AMSCs,利用流式细胞术鉴定细胞,EdU检测细胞增殖能力,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测基因表达,β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)染色检测细胞衰老情况,油红O和茜素红染色检测细胞的成脂和成骨分化能力,TUNEL检测细胞的凋亡情况．分离的BMSCs和AMSCs均高表达CD44和CD90,不表达CD45和CD34．与AMSCs相比,P8代BMSCs增殖能力强,OCT4和Ki67表达高,β-gal阳性细胞数少,成骨分化能力高．但在成脂分化能力方面,AMSCs强于BMSCs．进一步发现H2O2处理P8代细胞时,AMSCs比BMSCs对氧化损伤更敏感,细胞凋亡率显著增加,究其原因可能与抗氧化损伤基因表达的显著降低有关．     

红景天苷对BMSC生物学特性影响

目的：研究红景天苷对骨髓间充质干细胞（Bonemesenchymalstemcells,BMSCs）生物学活性影响。方法：采用贴壁法分离培养BMSCs,检测细胞表面分子表达对所获干细胞进行鉴定。以终浓度为10¨g／mL红景天苷与BMSCs共培养,通过形态学观察和MTT法分析研究其对BMSCs生物学特性影响。结果：成功培养出BMSCs,免疫荧光染色显示,培养的第3代BMSCs表达CD29、CD44干细胞标志。10μg／mL红景天苷与BMSCs共培养后,较对照组细胞生长更为旺盛,更为规整,形成典型的“鱼群状”。生长曲线显示,实验组细胞较对照组生长稳定,增殖能力活跃。结论：10μg／mL红景天苷可促进BMSCs增殖分化,又不影响细胞增殖分化等生物学特性。     

大鼠骨髓基质干细胞分离培养及向成骨、成脂诱导分化的研究

目的利用细胞原代及传代培养技术将大鼠骨髓基质干细胞诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,为其进一步应用奠定基础.方法全骨髓法分离大鼠骨髓基质干细胞,传代后分别在成骨、成脂诱导条件下继续培养,采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色及油红"O"染色观察其成骨及成脂分化结果.结果第2代大鼠骨髓基质干细胞成骨诱导9 d后碱性磷酸酶染色呈阳性细胞,连续诱导14 d后可见矿化结节形成,成脂诱导14 d后可见脂肪细胞形成.结论随着诱导条件的不同,大鼠骨髓基质干细胞在体外可定向分化为成骨细胞和脂肪细胞.     

Ι型骨质疏松山羊骨髓基质细胞体外成脂、成骨分化的研究

观察体外定向诱导Ι型骨质疏松山羊骨髓基质细胞(BMSCs)分化为脂肪细胞和成骨细胞。建立去卵巢骨质疏松山羊动物模型,全骨髓法分离培养其骨髓基质细胞。第二代细胞分别成脂、成骨诱导培养,油红O染色、碱性磷酸酶染色、茜素红染色判定其分化结果。成脂诱导21d,油红O染色有脂滴形成;成骨诱导14d,碱性磷酸酶染色阳性;连续诱导35d,茜素红染色证实有钙化结节形成。Ι型骨质疏松山羊骨髓基质细胞在体外可以定向诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。     

Ⅰ型骨质疏松山羊骨髓基质细胞体外成脂、成骨分化的研究

观察体外定向诱导Ⅰ型骨质疏松山羊骨髓基质细胞（BMSCs）分化为脂肪细胞和成骨细胞.建立去卵巢骨质疏松山羊动物模型,全骨髓法分离培养其骨髓基质细胞.第二代细胞分别成脂、成骨诱导培养,油红O染色、碱性磷酸酶染色、茜素红染色判定其分化结果.成脂诱导21 d,油红O染色有脂滴形成;成骨诱导14 d,碱性磷酸酶染色阳性;连续诱导35 d,茜素红染色证实有钙化结节形成.Ⅰ型骨质疏松山羊骨髓基质细胞在体外可以定向诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞.     

人胎儿骨髓间充质干细胞的分离及生物学鉴定

通过原代细胞培养,从引产胎儿骨髓组织中分离干细胞,然后进行生物学鉴定,旨在体外建立培养胎儿骨髓干细胞的有效方法,为进一步研究干细胞奠定基础．本研究对四个月的引产胎儿骨髓组织进行原代细胞培养,采用贴壁筛选法,在含有15％胎牛血清的L-DMEM／IMDM(1:1)混和培养液中培养,7 d后细胞可长满瓶底．显微镜下观察,细胞形态均一,呈长梭形．传代后,在8代以内的细胞贴壁能力较强,生长速度较快．将其命名为BMMS-03．在第3代时,对培养的细胞进行了于细胞标志物的生物学鉴定,采用流式细胞仪对经免疫荧光染色的细胞进行检测．结果显示:97．2％的细胞呈CD105阳性反应,66．0％的细胞呈CD106阳性反应, 9．2％的细胞呈CD34阳性反应．阴性对照组阳性反应为0．5％．生物学鉴定的初步结果提示,从胎儿骨髓组织中分离培养成功的细胞为骨髓间充质干细胞,其细胞形态学特征、CD105 、CD106 和CD34-的检测结果均符合间充质干细胞的特征．本研究成功地建立了体外培养胎儿骨髓间充质干细胞的有效方法,所获得的间充质干细胞纯度较高,增殖较快,适用于干细胞生物学和组织工程学的研究．     

人胎骨髓MSCs的分离鉴定及其向脂肪和成骨细胞的分化

目的:分离鉴定人胎骨髓中的间充质样干细胞(m esenchym al-like stem cell,MSCs),探索其体外培养的生物学特性。方法:利用细胞差速贴壁生长特性分离纯化人胎骨髓间充质样干细胞;利用流式细胞仪检测其细胞周期和表面标志;添加常规诱导液诱导其向脂肪、成骨方向分化,并利用特异性细胞化学染色法加以鉴定。结果:从人胎骨髓中成功分离、纯化得到间充质样干细胞,P4代细胞有92.3%的细胞处于G0/G1期;P5代细胞有96.1%的细胞处于G0/G1期;流式细胞仪检测P3代细胞结果显示:人胎骨髓MSC表达CD15、CD29、CD44、CD105、CD106和CD166,不表达造血细胞标志CD34、CD45,不表达与GVHD相关的HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L。在经典的诱导条件下,人胎骨髓MSCs可迅速向脂肪及成骨方向分化。结论:人胎骨髓中含有丰富的间充质样干细胞,具有较强的多向分化潜能,且免疫原性弱,是组织工程的较为理想的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离及分化潜能鉴定

用全骨髓贴壁法从SD大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)。为鉴定其成骨分化潜能,将大鼠BM-MSCs进行成骨诱导培养,第7天用碱性磷酸酶染色显示有碱性磷酸酶阳性细胞,第21天进行茜素红染色有矿化骨节形成。为鉴定其成脂分化潜能,将大鼠BM-MSCs先在成脂诱导培养基中培养,再换为在成脂肪维持培养基中培养,第10天进行油红O染色有脂滴形成。表明从SD大鼠骨髓中成功分离得到具有多向分化潜能的大鼠BM-MSCs,为其作为种子细胞应用于临床或研究奠定基础。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的研究

目的：探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞（ＭＳＣs）向胰岛β样细胞分化。方法：在无菌条件下从正常成人骨髓中分离间充质干细胞,体外培养传3代后用表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、β-巯基乙醇和高糖培养基诱导MSCs向胰岛β样细胞分化。观察MSCs在诱导前后的形态变化;用胰岛素免疫细胞化学染色检测胰岛素的表达;用双硫腙染色鉴定胰岛β样细胞。结果：未经诱导的MSCs在培养体系中呈贴壁生长,长梭形,经诱导分化后,细胞逐渐变圆,并聚集成团;胰岛素免疫细胞化学表明细胞团内的细胞呈胰岛素染色强阳性反应：双硫腙染色阳性。结论：人骨髓间充质干细胞可在体外被定向诱导分化为胰岛β样细胞。     

大鼠骨髓基质细胞体外定向诱导成骨

将大鼠骨髓单细胞悬液静置培养36h，利用骨髓基质细胞贴壁能力强的特点对其进行纯化和扩增培养。采用爬片培养、HE染色、组化染色以及碱性磷酸酶活性和钙含量测定等手段研究培养骨髓基质细胞的形态、分化和分泌基质情况。结果表明，非诱导培养条件下骨髓基质细胞呈梭形，部分传代细胞中可观察到脂肪细胞和肌细胞。经成骨性诱导培养后，骨髓基质细胞发生明显的形态学变化，碱性磷酸酶活性上升，钙含量增加，最终形成典型的矿化结节。提示培养大鼠骨髓基质细胞具有分化成脂肪细胞和肌细胞的能力，但其分化成骨的潜能最为强大。本实验诱导骨髓基质细胞分化为成骨细胞的模式有可能适用于骨组织工程研究。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞表达酪氨酸羟化酶

目的:探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)表达酪氨酸羟化酶,为帕金森病细胞移植替代治疗提供特异性分化的细胞.方法:在无菌条件下从SD大鼠的股骨中分离骨髓间充质干细胞,体外培养传3代后,用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和抗坏血酸诱导MSCs 表达酪氨酸羟化酶.在镜下,观察MSCs 在诱导前后的形态变化;用免疫荧光染色检测酪氨酸羟化酶的表达.结果:MSCs经诱导分化后,胞体逐渐变圆,并伸出神经轴突、树突样突起;免疫荧光化学表明细胞酪氨酸羟化酶染色呈强阳性反应.结论: SD大鼠骨髓间充质干细胞在体外能被定向诱导表达酪氨酸羟化酶,有可能为帕金森病治疗提供特异性分化的细胞.     

人与大鼠脂肪干细胞提取方法及生物学特性的比较研究

目的:研究人脂肪干细胞与大鼠脂肪干细胞的提取方法并对比差异,对培养出的细胞做形态学观察及表面标记鉴定.为今后ADSCs分化能力相关研究提供方法及依据.方法:获取人脂肪及大鼠脂肪,利用胶原酶消化法进行ADSCs提取,消化传代以纯化细胞.对比观察细胞形态,并取第3代的细胞进行细胞爬片HE染色、生长曲线测定、成脂和成骨诱导,流式鉴定表面标记物.结果:在相同的培养环境下,两种细胞均呈成纤维细胞样贴壁生长,h ADSCs原代第3天,r ADSCs原代第1天即可见较多细胞伸展为长梭形或短梭形,HE染色可见二者大小形态差异;成脂及成骨诱导组分别用油红"O"、茜素红染色为阳性,对照组为阴性.传代培养后,h ADSCs约1周,r ADSCs约6 d长满.流式鉴定示:二者均CD29(+),CD45(-),CD90(+),CD106(-),符合间充质干细胞特性.结论:本实验建立了高效提取ADSCs的方法,经过比较发现r ADSCs成骨能力较弱,在进行成骨向分化研究时不推荐首选;成脂能力与h ADSCs相似.r ADSCs是较好的动物来源脂肪干细胞,可广泛应用于再生医学研究.     

大鼠骨髓间质干细胞的分离纯化与鉴定

采用密度梯度离心法分离骨髓间质干细胞,差速贴壁法进行纯化,应用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等对纯化细胞进行鉴定,结果细胞表面抗原CD２９,CD４４,CD１０５,CD１６６表达呈阳性,而CD１４,CD３４,CD４５表达呈阴性。采用RT唱PCR鉴定了三个基因：nestin,NST,Oct唱４,前两者呈阳性表达,后者弱阳性表达。这些细胞特异抗原与基因表达综合起来,表明得到的细胞具备骨髓间质干细胞的特性。密度梯度分离与差速贴壁相结合,可获得较好均一性的骨髓间质干细胞,是一种简单可靠、易于推广的骨髓干细胞获取方法,可为细胞与组织工程研究提供种子细胞。     

兔骨髓基质细胞的分离培养研究

目的分离培养兔骨髓基质细胞,观察其体外生长特性.方法用密度梯度离心结合贴壁培养法分离兔骨髓基质细胞,进行体外培养,传代扩增,测定其生长曲线,用相差显微镜、细胞化学染色观察细胞生物学性状及功能特点.结果密度梯度离心结合贴壁培养法可有效分离并且纯化兔的骨髓基质细胞.传代细胞均一性较好,呈纺锤形,细胞增殖快,加入地塞米松(Dxm 10-5 mmol/L),β-甘油磷酸钠(β-GP 2 mmol/L)、L-抗坏血酸(AA 50 mg/L)可诱导BMSCs分化为成骨细胞,von kossa法检测骨钙素阳性.结论体外培养的骨髓基质细胞生长稳定,增殖力强,可诱导分化.     

大鼠半月板纤维软骨细胞的分离、培养与鉴定

探讨体外大鼠半月板纤维软骨细胞分离培养与鉴定的实验方法,观察不同代次间细胞的形态学特征.手术分离大鼠双膝内外侧半月板,采用胰酶和Ⅱ型胶原酶消化法提取细胞,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光法鉴定细胞,低糖DMEM完全培养液常规培养.结果表明,原代半月板细胞形态呈多角形,轮廓清晰,8～10d可铺满瓶底;传代后的1～3代细胞,其贴壁及增殖能力加强,生长状态良好;传至4～5代尤其是第5代之后,细胞表型不稳定,密度稀疏,形态以长梭形为主且不规则,清晰度下降,传代周期延长;细胞鉴定结果呈阳性.双酶消化和低糖DMEM完全培养液常规培养可以获得具有良好生物学特性的半月板细胞,第4代之前的半月板细胞可以为运动损伤的组织工程学研究提供种子细胞.     

光损伤视网膜片培养上清液诱导大鼠骨髓间充质干细胞为视网膜样细胞的研究

目的:探讨大鼠视网膜片光损伤后诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)成视网膜细胞的可能性。方法:实验研究。采用贴壁筛选法分离、培养SD大鼠骨髓MSC细胞,经流式细胞仪鉴定后,用大鼠视网膜片光损伤后的上清液与10%FBS的LG-DMEM以2:3混合成的条件培养液诱导MSC细胞7～8d。用免疫细胞化学染色和RT-PCR观察诱导后的细胞是否表达视紫红质、GFAP、NSE。结果:第3代MSC细胞经诱导后有(36.64±7.84)%表达rhodopsin,(20.21±6.47)%表达GFAP,(21.83±2.98)%表达NSE。RT-PCR鉴定结果分析示GFAP、NSE、Rhodopsin mRNA均有表达。结论:光损伤SD大鼠视网膜片培养上清液可诱导MSCs分化为视网膜样细胞。     

骨髓间充质干细胞移植治疗四氯化碳大鼠肝纤维化的实验研究

目的通过移植大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)治疗肝纤维化大鼠,并评价其疗效。方法通过全骨髓贴壁法分离培养纯化大鼠BMSC,用流式细胞仪对第3代BMSC进行表面抗原鉴定。选取清洁雄性SD大鼠20只,利用四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl_4)皮下注射构建大鼠肝纤维化模型,将肝纤维化大鼠随机分为BMSC组、PBS组,每组10只;分别通过尾静脉注射,予1 mL细胞浓度为1×10~6个/mL的BMSC细胞悬液、1mL PBS溶液,另取6只健康雄性SD大鼠作为空白对照组;移植后第5周处死各组大鼠,采集血液检测大鼠肝功;取肝脏组织切片进行HE、Masson染色,观测大鼠肝细胞组织损伤及纤维化程度,利用Image J软件计算肝脏胶原容积分数(Collagen Volume Fraction,CVF);通过qRT-PCR检测各组大鼠肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达。结果(1)通过流式细胞术鉴定BMSC表面抗原,CD29、CD90高表达,CD45低表达。(2)与PBS组比较,BMSC组大鼠肝脏肝小叶网状结构较完整,CVF降低且Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达减少(P0. 05)。(3)与PBS组相比,BMSC组大鼠肝功能改善,且差异具有统计学学意义(P0. 05)。结论同种异体移植BMSC可以有效减少肝脏胶原沉积,改善肝纤维化大鼠肝脏功能。     

人骨髓间充质干细胞不同亚群

目的 比较不同亚群的人骨髓间充质干细胞(human bone mesenchymal stem cell, hBMSC)自我更新和分化能力。方法 通过获赠的人髂骨骨髓标本,联合运用密度梯度离心和差异贴壁法分离MSCs , 用10μm 滤膜将不同群体细胞分离,倒置相差显微镜观察不同亚群细胞的形态;流式细胞仪检测BMSC不同亚群细胞的表型;在地塞米松、Vit C、β-磷酸甘油钠作用下将不同亚型细胞向成骨细胞诱导分化,分别观察其分化能力。结果 成熟的MSC,即mMSCs 细胞(mature cells)呈纤维样梭形, RS 细胞(rapidly MSC self-renewing cells)呈圆形。RS细胞增殖能力明显强于mMSCs。经定向诱导分化后,RS细胞向成骨细胞分化能力较mMSCs细胞强。结论 RS 细胞较之mMSC细胞可能是一种更原始的中胚层前体细胞,具有更强的自我更新和分化潜能。