一种新型有机磷降解酶的二异丙基氟磷酸酯水解特性研究

有机磷降解酶是降解有机磷化合物(包括神经毒剂)的一类重要酶.本实验室克隆了铜绿假单胞菌HS-D38的有机磷降解酶基因opd(organophosphate degradation),并经定点突变与原核表达获得了一种新型重组有机磷降解酶OPD.本文研究了该重组有机磷降解酶OPD的分离纯化,及其降解有机磷神经毒剂模拟剂二异丙基氟磷酸酯(diisopropyl fluorophosphate,DFP)的性质.研究结果表明,重组有机磷水解酶OPD经Ni-NTA亲和色谱纯化后,比活力达到了218U/mg.该酶的最适温度为35℃,最适pH为8.0;金属离子Zn2+、Cr2+、Co2+对酶活性有激活作用.重组有机磷水解酶OPD对DFP的Km为1.05mmol.L-1,Vm为0.218mmol.L-1.min-1.     

有机磷水解酶的大肠杆菌细胞表面展示

PCR扩增来自黄杆菌ATCC27551的有机磷水解酶基因opd,直接与XcmⅠ酶切去除Ampr基因片段的pZXL-T连接,将opd克隆于锚定单元Lpp-OmpA编码序列下游,转化E.coliBL21(DE3).经抗性筛选、PCR鉴定和测序证实,成功构建了具有全细胞催化效应的大肠杆菌细胞表面展示工程菌.SDS-PAGE结果表明,工程菌能表达产生51 kD的融合蛋白.细胞表面展示的有机磷水解酶具有较高全细胞酶活性,用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低90%.     

gfp融合的甲基对硫磷水解酶基因mph在E. coli中的表达

依照大肠杆菌密码子的偏爱性将来源于Pseudomonas sp. M6的有机磷水解酶基因mph设计合成了新的有机磷水解酶基因,然后将其与GFP融合进行表达,构建一株具有全细胞催化活性的大肠杆菌工程菌.设计优化后所合成的mph-r基因全长927 bp,然后将基因克隆到p ET23a-gfp大肠杆菌表达型质粒上,成功构建了重组表达质粒p ET23a-gfpmph-r,转化大肠杆菌感受态Rosetta blue.经过诱导剂IPTG的低温诱导24 h后,收集细胞,通过SDS-PAGE和Western Blot检测融合蛋白的表达.实验结果显示,融合蛋白的表达量大大提高,且通过酶活分析测定,全细胞酶活达到了11. 2 U/m L.     

酶反应偶联离子色谱法检测甲胺磷农药

有机磷农药的检测一直是人们感兴趣的研究课题.本文介绍了应用酶反应偶联离子色谱法测定甲胺磷农药.该方法基本原理是:植物水解酶促进乙酸萘酯分解生成乙酸.甲胺磷农药抑制植物水解酶的活性,植物水解酶的活性随甲胺磷浓度增加而降低,乙酸萘酯分解生成的乙酸也减少,离子色谱能够快速灵敏准确的检测生成的乙酸的减少量,由生成的乙酸的减少量定量甲胺磷农药.应用本方法,测定了甲胺磷农药,线性范围在0.24～120μg/mL,相对标准偏差(RSD%)=5.3%,测定结果准确灵敏.     

广谱降解有机磷农药的真菌酶解研究

从农药污染土壤中分离出的一株真菌具有广谱降解有机磷农药的能力.菌体培养物经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-Sephrose CL6B柱层析纯化广谱有机磷农药水解酶.研究结果表明该酶为胞内酶,主要定位在细胞膜上.酶的最适反应温度为45℃,最适pH7.5,在50℃以下以及在pH6～9.5范围内活性稳定.Hg2 、Fe3 、对氯高汞苯甲酸、碘乙酸和N-乙基马来酰亚胺对该酶有强烈的抑制作用,而Cu2 、巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、谷光甘肽和去污剂对酶有不同程度的激活作用.该酶不仅可以作用于含P-O键的有机磷农药;而且也能水解含P-S键的有机磷农药.以甲基对硫磷和内吸磷为底物的Km值分别为63μmol/L,256μmol/L;Vmax分别为306μmol·min-1,189 μmol·min-1;Kcat分别为1 102 s-1,610 s-1.     

哺乳动物中的可溶性环氧化物水解酶*

哺乳动物中的可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)是一种集N-末端磷酸酶活性和C-末端水解酶活性于一体的同型二聚体酶.它对异生物质具有解毒功能,并参与多种生理调控过程,在血压控制和激素调节方面发挥着重要作用.本文从哺乳动物sEH的分子结构、催化机理以及功能等方面做一概述.     

核酸水解酶及酶解法生产核苷酸研究进展

综述了目前主要核酸水解酶的种类、来源、蛋白质特性和生产方法;介绍了目前酶解法生产核苷酸的几种主要方法,比较了各种方法的优缺点及工业化应用前景;简单综述了水解液中四种核苷酸的分离提取方法;探讨了酶解法生产核苷酸的未来研究方向.结论为酶解法的关键是必须通过广泛采用现代高新生物技术来降低生产成本.     

均匀设计法优选鹿茸酶解工艺的最佳酶配比

目的优选鹿茸酶解工艺条件。方法以鹿茸酶解液中总氮转化率为指标,采用均匀设计法筛选最佳酶配比。结果酶解工艺最佳酶配比为蛋白水解酶A浓度1.5%,蛋白水解酶B浓度1.2%,蛋白水解酶C浓度0.4%,鹿茸总氮转化率为70.3%。结论本试验结果可为鹿茸酶解工艺的确定提供依据。     

植物水解酶法快速测定环境水样中有机磷及氨基甲酸酯类农药

应用植物水解酶抑制技术快速检测水样中有机磷及氨基甲酸酯类农药 ,对反应的温度、pH和时间进行优化 .常用的几种有机磷及氨基甲酸酯类农药的测定限在 0 .0 0 15～ 0 .33mg·L-1范围内 .应用本方法对被农药污染的某河段进行了监测     

烤烟叶面微生物5种水解酶的产生、温度稳定性及其在烟叶人工陈化中的应用

研究了烤烟叶面微生物菌株5种水解酶（β 淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶和蛋白酶）的诱导产生及其温度稳定性,结果发现培养基中分别添加0.2%的5种水解酶相应的诱导物,对所研究的烤烟叶面微生物菌株5种水解酶的产生均具有诱导作用.5种水解酶在60?℃时均不稳定,易失活;50?℃时,除果胶酶外,其他4种水解酶的温度稳定性较好.在对5种水解酶60?℃保温2?h过程中所取的样品测定酶活时发现,60?℃反应所得的酶活都高于各自酶活测定常规方法中所用温度反应所得的酶活.用烤烟叶面微生物及其产生的5种水解酶组合成6种不同配方,对2个品种的烤烟进行了为期6个月的人工陈化试验,结果是人工陈化2个月后试验样品评吸总分普遍高于对照样品.本研究为进行烤烟人工陈化以缩短烤烟自然陈化周期、改善烟叶内在品质奠定了基础.     

复合植物水解酶提取花生油脂体工艺研究

为了提高花生油脂体的提取率,选用复合植物水解酶辅助提取花生油脂体。通过单因素实验考察了料液比、酶用量、酶解时间、酶解温度对复合植物水解酶提取花生油脂体提取率的影响。在单因素实验的基础上,采用正交试验对复合植物水解酶提取花生油脂体的工艺进行优化。实验结果表明,在所选取的参数范围内,各因素对花生油脂体提取率的影响由大到小为:料液比、酶解温度、酶解时间、酶用量。获得其较佳工艺条件为料液比1∶4 (g/mL)、酶用量1.25%、酶解时间80min、酶解温度50℃,在该条件下花生油脂体提取率为48.92%。     

急性有机磷农药中毒的相关进展

有机磷农药中毒是一种常见病、多发病,尤以农村多见.经口及呼吸道吸入进展迅速。如果抢救不及时,病死率很高,本文阐述了急性有机磷中毒有机磷毒作用机理的研究,关于三个时相的神经毒作用的认识,胆碱能危象,中间综合征,迟发神经毒性,目前主要措施仍然是清除毒物、应用特效解毒药物、血液灌支持综合治疗,但是疗效仍不尽如人意,通过急性有机磷中毒有机磷毒作用机理的了解,提高抢救成功率.     

固定化脲酶的制备及其在废水处理上的应用

固定化酶和固定化细胞近年来获得迅速发展,虽然早在1916年已有固定化酶的研究报导,但作为工业上的生产应用是在七十年代才开始的,目前较大量生产应用的固定化酶主要有葡萄糖异构酶,氨基酸酸化酶,蛋白质水解酶和脲酶等.目前固定化脲酶主要应用于医疗和制备脲酶膜电极.应用于含尿素废水处理报导极少,主要有荷兰的报导,是关于用砂子作为载体的固定化脲酶的逆流多层床应用于已解吸氨的含尿素废水处理.目前国际上应用于化肥厂尿素废水处理的方法主要是高温高压水解法,我国也进口了一套这种装置,但至今尚未正常运行,主要原因是消耗能源较多.所以化肥厂的含尿素废水处理问题至今仍未基本解决.本文主要介绍固定化脲酶性质与载体结构关系及其应用于含尿素废水处理的部分结果.     

动植物酶制剂

一、国外动植物酶制剂生产应用概况酶是一类生命体产生的具有催化功能的蛋白质,也称生物催化剂。由于酶促反应有高效、专一、温和的特性,现在已越来越受到人们的重视。以植物酶来说,国外主要利用对象是植物蛋白水解酶,其中最大一宗酶种是木瓜蛋白酶(Papain)。在整个热带地区都有它的生产和加工场所。单以美国来说,年进口粗木瓜酶即达500吨,世界年产量达600吨。日本的木瓜酶年产量达27吨(单价每Kg15000—20000日元)。它主要用于防止啤酒冷混浊和做肉类嫩化剂。此外,也广泛用于水解蛋白、制药和作为遗传工程的工具酶。法国近年已大量利用木瓜酶做鱼品加工,其中包括将杂碎鱼部分水解加工成禽、畜易于消化的饲料。     

敌百虫对蚯蚓体内几种解毒酶活性的影响

为了解蚯蚓对有机磷农药敌百虫毒害的抗药性机制,采用滤纸接触法,将不同质量浓度的敌百虫作用于内蒙古赤峰市周边地区蔬菜大棚的蚯蚓,提取相应的解毒酶,用试剂盒和酶标仪等测定酶活性.结果显示:经不同质量浓度的敌百虫处理后,蚯蚓体内的谷胱甘肽转移酶(GSTs)、乙酰胆碱酯酶(ACh E)和羧酸酯酶(Car E)活性均先随着敌百虫质量浓度的增大而增加,达到峰值后,随着敌百虫质量浓度的进一步增大,3种解毒酶的活性下降.敌百虫质量浓度为0.06 g/L时,GSTs活性达到最大;敌百虫质量浓度为0.04 g/L时,ACh E和Car E活性最大,GSTs的活性也较高.     

利用剩余活性污泥制备洗涤用酶制剂的研究

研究了剩余活性污泥中复合水解酶的提取分离及制成洗涤用复合水解酶制剂的方法.离心脱水的污泥按料液比1:2加入1％的Triton X-100水溶液搅拌提取60 min,蛋白酶的提取率为71.7％;酶提取液经膜分离和浓缩后用70％乙醇沉淀,沉淀经冷冻干燥得复合水解酶粉末,每千克剩余活性污泥可制备1.7 g复合水解酶粉,其中胶...     

纤维素酶制剂中葡聚糖纤锥二糖水解酶活力的测定

根据真菌纤维素酶系中β-葡聚糖纤维二糖水解酶,内切β-葡聚糖酶以及纤维二糖酶在棉纤维上吸附和脱吸附性质的不同,拟订了一种可选择性地测定β-葡聚糖纤维二糖水解酶活力的方法。β-葡聚糖纤维二糖水解酶强烈吸附于棉纤维上,而且不为1 mol/L,pH4.8的醋酸缓冲液所洗脱;只有部分内切β-葡聚糖酶为棉纤维所吸附,但在上述条件下可完全被洗脱。纤维二糖酶不被吸附。在此基础上,再借助β-葡聚糖纤维二糖酶与内切β-葡聚糖酶的协同作用,可在后者过量存在的条件下,定量测定β-葡聚糖纤维二糖水解酶活力。用两种商品纤维素酶制剂验证了本方法的可靠性。     

微生物果胶酶研究及其在食品加工中的应用进展

果胶酶是一类能够分解果胶物质的复合酶．根据作用机理将其分为四大类：果胶酯酶、果胶水解酶、果胶裂解酶和原果胶酶．果胶酶最主要来源是通过大规模微生物发酵生产,本文综述了微生物果胶酶的分类、生产菌、分子生物学研究、分离纯化、发酵生产方式及微生物果胶酶在食品加工的应用．     

虾蛄蛋白酶法水解条件的研究

本文主要探讨了酶水解虾蛄的具体工艺。通过酶的选择，确定了胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶作为水解酶。在此基础上，提出并确定了用混合酶水解虾蛄蛋白的新工艺。     

乳酒隐球酵母变种CK-1产β-半乳糖苷酶发酵条件优化

β-半乳糖苷酶是一类非常重要的糖苷水解酶,已被广泛应用于食品工业降低乳制品中的乳糖含量.本文通过单因素实验和L9(34)正交实验,对乳酒隐球酵母变种CK-1产生β-半乳糖苷酶的培养基组成和发酵条件进行了优化.结果表明,在以乳糖2.0%、硫酸亚铁铵2.0%、磷酸二氢钾0.4%、起始pH6.0的培养基中,按接种量8%接种后,于30℃,120 r.min-1培养CK-1菌株2 d,β-半乳糖苷酶活力可达(17.02±0.38)U.mL-1,是优化前(基础发酵培养基酶活力(5.39±0.20)U.mL-1)的3.16倍.通过优化培养条件提高了CK-1菌株的产酶量,为商业化β-半乳糖苷酶的大量生产降低了成本.