鲍鱼肌原纤维结合型蛋白酶的初步鉴定

研究了皱纹盘鲍腹足肌肉中肌原纤维结合型蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解作用.SDS-PAGE结果显示,肌原纤维在55~60℃下,肌球蛋白重链(Myosin Heavy Chain,MHC)和副肌球蛋白(Paramyosin,PM)会发生明显的降解.金属蛋白酶抑制剂EDTA、1,10-phenathroline能够有效抑制MHC和PM的分解.EDTA以及丝氨酸蛋白酶抑制剂benzamidine共同作用几乎可完全抑制蛋白质降解,揭示鲍鱼肌肉中存在肌原纤维结合型金属蛋白酶(Metalloproteinase,MP)和丝氨酸蛋白酶(Serine proteinase,SP).通过加热、强离子浓度溶液抽提相结合的方式,从肌原纤维蛋白中初步分离出这两种酶.分别利用这两种酶对肌原纤维蛋白进行降解,发现最适温度均在60℃左右,与肌原纤维蛋白自身降解的最适温度(55~60℃)相吻合.对SP的底物特异性分析结果表明,制备的丝氨酸蛋白酶对P1位为Arg残基的荧光底物有较高的分解作用,而对P1位为Lys残基的底物分解较弱.     

鲤鱼红色肉中金属蛋白酶的分离纯化与性质分析

通过硫酸铵盐析、DEAE—Sephacel离子交换、Sephacryl S-200凝胶过滤、High-Q离子交换和Gelatin—Sepharose亲和层析等方法,从鲤鱼红色肉中纯化得到分子量为75ku的金属蛋白酶．该酶在碱性条件下显示活性,活性温度范围为30～50℃．金属蛋白酶抑制剂EDTA和EGTA能够完全抑制该酶的活性,而其他蛋白酶类抑制剂则不起抑制作用．进一步研究发现,该酶能够有效分解Ⅰ型胶原蛋白和明胶,说明其在鱼体死后肌肉软化过程中起着重要作用．     

鲤鱼过敏原(胶原蛋白)的体外模拟消化

首先采用酸法提取纯化鲤鱼过敏原(胶原蛋白),依据美国药典提供的模拟胃液、肠液配方,分别利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对纯化的胶原蛋白进行酶解消化,以SDS-PAGE和免疫印迹分析测定纯化的胶原蛋白在体外模拟胃液、肠液中的消化稳定性及免疫原性.结果表明,鲤鱼胶原蛋白经模拟胃液(胃蛋白酶)消化15 min出现较为明显的降解,消化1 h的产物仍具有一定的免疫原性;经模拟肠液(胰蛋白酶)消化30 min出现较为明显的降解,消化3 h的产物仍具有一定的免疫原性;经模拟肠液(胰凝乳蛋白酶)消化1~4 h均未出现明显降解,其消化产物仍具有较强的免疫原性.结果提示,鲤鱼胶原蛋白的耐消化性及免疫原性可能是导致食物性过敏反应的重要原因.     

鱼类基质金属蛋白酶研究进展

基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)是一类高度保守的生物活性依赖于金属离子的内切酶家族,是参与降解细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的重要蛋白酶,MMP几乎能降解细胞外基质的所有成分.研究发现,MMPs参与鱼类胶原蛋白的降解,是导致鱼类死后肌肉软化的重要原因.综述了基质金属蛋白酶的分类、结构、调节机制以及它们对鱼类肌肉胶原蛋白的作用.     

蓝圆鲹分离蛋白水溶性蛋白酶的鉴定及性质

以蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)为研究对象,采用酸/碱溶解-等电点沉淀法制备蓝圆鲹肌肉分离蛋白(acid/alkaline aided protein isolate,API/KPI),分析比较不同分离蛋白与肌肉全蛋白(total protein,TP)的自身降解规律,并对其水溶性蛋白酶的酶学性质展开研究。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结果显示,TP与KPI均会发生强烈的自身降解现象,API则无明显的自身降解。酶谱与酶活力测定结果表明,KPI保留了TP超过80%的酶活性,而API则仅剩10%的水解活性。酶学性质结果表明,TP的内源酶具有两个最适p H值,分别为3. 0与9. 0,而KPI的最适p H值为9. 0; TP与KPI内源酶的最适温度均为60℃。荧光底物结果表明,TP与KPI的最适荧光底物为Boc-Gln-Arg-Arg-MCA,且对羧基端为Arg的底物均具有较高的水解活性。抑制剂结果显示,TP和KPI水溶性蛋白酶都能被丝氨酸蛋白酶抑制剂强烈抑制,暗示水溶性丝氨酸蛋白酶在碱法等电点制备的分离蛋白凝胶劣化中起关键作用。     

碱性和中性食线虫真菌丝氨酸蛋白酶动力学行为差异研究

食线虫真菌丝氨酸蛋白酶被认为是病原真菌感染线虫最重要的毒力因子之一.研究表明,碱性体壁降解丝氨酸蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的催化活性和杀线虫活性.研究选取中性丝氨酸蛋白酶PII和碱性丝氨酸蛋白酶PR1为研究对象,通过分子动力学模拟、元动力学模拟和本质动力学分析等手段研究二者的结构动力学差异及对催化能力的影响.研究结果表明,模拟过程中PII比PR1具有更高的全局构象柔性; PII较PR1具有更为粗糙的自由能表面和更高的自由能最小化值,说明PR1比PII具备更高的热稳定性和全局结构稳定性.对于两者底物结合区域柔性的比较结果表明,PR1的底物结合区域比PII具备更高的RMSF、Rg和SASA,同时具备更少NHB和NNC,说明PR1底物结合部位具有更强的构象柔性.通过对二者的模拟平衡轨迹进行本质动力学分析表明,PII和PR1具有不一样的主要运动模式,PII的大尺度协同运动主要为分子表面环区的运动,而PR1的大尺度协同运动则是底物结合区域与功能相关的协同运动.以上动力学行为的差异可能使得碱性丝氨酸蛋白酶PR1较中性丝氨酸蛋白酶PII具备更强的催化活性和杀线虫活性.     

理性设计降低碱性蛋白酶的胶原降解活力

以克劳氏芽胞杆菌来源的碱性蛋白酶(PRO)为研究对象,运用HotSpot Wizard 3.0设计了PRO在Gly97-Gly102 loop区的突变库,筛选得到了胶原蛋白降解活力显著降低的G97E突变体.G97E突变体的碱性蛋白酶活力和胶原蛋白降解活力分别为野生型PRO的91.97％和65.84％;最适温度和最适pH...     

鞣花酸衍生物的合成及抑制HCV NS3蛋白酶活性

从中草药叶下珠中活性追踪、提取出具有体外抑制HCV NS3丝氨酸蛋白酶活性的先导化合物——鞣花酸,进而化学合成鞣花酸的衍生物并用NMR和MS确定结构;采用ELISA法测定了所合成鞣花酸衍生物体外抑制HCV-NS3丝氨酸蛋白酶的活性.     

章鱼内脏胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与性质研究

通过热处理、硫酸铵盐析、膜超滤及SP-Sepharose 离子交换层析,从章鱼内脏中纯化得到一种胰蛋白酶抑制剂 (Octopus Trypsin Inhibitor ,OTI)．Tricine-SDS-PAGE 电泳结果显示,OTI的分子质量约为6500 u．性质分析结果表明:OTI在pH=1.0~11.0缓冲液中孵育30 min,抑制活性稳定;在100 ℃下加热1 h、2 h 后仍分别具有90% 和65% 的抑制活性,具有良好的pH值稳定性和热稳定性;OTI能够显著抑制胰蛋白酶的活性,对胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶几乎无抑制活性;OTI能够有效抑制蓝圆鲹肌肉中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶 (MBSP) 引起的肌球蛋白降解．     

鲤鱼胶原蛋白的过敏原性研究

以鲤鱼鱼皮为研究对象,通过碱溶、酸溶、NaCl盐析等方法从鱼皮中分离纯化得到了胶原蛋白.SDS-PAGE分析显示,鲤鱼胶原蛋白由分子质量约为120 ku和115 ku的2条α链（α1与α2）、分子质量约为250 ku的β链以及大分子质量的γ链组成.分析比较鲤鱼胶原蛋白与鲢鱼小清蛋白的基本性质,结果显示：2种蛋白质的pH...     

鲤鱼肌肉Ⅴ型胶原蛋白的分离纯化及其抗体制备

通过酸溶、胃蛋白酶酶解和氯化钠盐析等方法,从鲤鱼肌肉中纯化得到了V型胶原蛋白.SDS-PAGE电泳图谱分析发现,其至少由2条α链(α_1和α_2)组成,其中α1分子质量约为135 ku,α_2分子质量约为120 ku.通过圆二色光谱仪分析其二级结构,发现其具有胶原蛋白三股螺旋结构的典型特征,其热变性温度为30.5℃.将V型胶原蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,成功制备了多克隆抗体.采用免疫印迹法对该多克隆抗体的特异性进行分析,证明其仅与鱼类V型胶原蛋白产生反应,特异性良好.     

邻苯二甲酸二甲酯对鲤鱼代谢酶类及抗氧化活性影响

为研究邻苯二甲酸二甲酯(DMP)对鲤鱼的急性毒性作用.选取邻苯二甲酸二甲酯为研究对象,探讨其对鲤鱼肝脏有关代谢酶类活性的影响以及对鲤鱼抗氧化活性的改变.结果表明,除最低浓度组(1.0μg/L)外,其余各实验组邻苯二甲酸二甲酯对鲤鱼血清反映肝功能的有关酶类如丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰基转移酶(γ-GT)活性均有显著性升高;同时,鲤鱼肝细胞、鱼鳃和肌肉中的超氧化物歧化酶(SOD)活性表现为显著性降低,而膜脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量却显著性升高.说明一定浓度的邻苯二甲酸二甲酯对鲤鱼肝脏具有明显毒性,对鲤鱼的抗氧化能力有明显损伤作用.     

HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在大肠杆菌中表达、纯化

在大肠杆菌中HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶获得表达并进行纯化.根据NS3与NS4A两者形成异源二聚体的结构要求,并参照文献,通过基因拼接的方法设计了单链NS3/4A丝氨酸蛋白酶的基因.合成相应引物,利用反转录PCR从HCV患者血液中扩增出该蛋白酶的编码基因,克隆入原核表达载体pRSET-A,将重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a转化BL211(DE3)大肠杆菌,并诱导表达与纯化.成功地构建了重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a;重组质粒转化的BL21工程菌经IPTG诱导表达后,表达产物经SDS-PAGE和western-h1ot证实为NS3/4A丝氨酸蛋白酶,并用镍离子亲和层析方法获得纯化蛋白酶.获得的纯化NS3/4A丝氨酸蛋白酶为建立其酶活性测定系统奠定了基础.     

驴精子顶体蛋白酶的提纯及其一些性质的研究

顶体蛋白酶acrosin(EC3、4、21、10)是存在于哺乳动物精子顶体中的一种丝氨酸蛋白酶,生化性质上属于水溶性碱性糖蛋白,专一水解精氨酰键,最适pH为8.0—8.5。首先在兔精子中提取了顶体蛋白酶,发现此酶能分解兔卵透明带,并且被胰蛋白酶抑制剂所抑     

草鱼胰蛋白酶的分离纯化及性质研究

从草鱼肝胰脏中分离纯化出一种胰蛋白酶．纯化过程包括：硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sephamse离子交换,Sephacryl S-200凝胶过滤和Q-Sepharose离子交换层析．SDS-PAGE显示在分子量约为28．5ku处有单一电泳带,表明该酶已得到高度纯化．以Boc-Leu-Arg-Arg-MCA为底物测得该酶的最适温度为40℃．最适pH值为9．0．丝氨酸蛋白酶抑制剂（Pefabloc SC,PMSF,Benzamidine）对该酶的活力有明显抑制作用．底物特异性实验表明该酶特异性分解精氨酸和赖氨酸残基的C末端,进一步证明纯化蛋白为草鱼胰蛋白酶,其酶学性质与鲤鱼胰蛋白酶相似．     

基质金属蛋白酶与肿瘤关系研究进展

基质金属蛋白酶是一组Zn2+依赖性蛋白水解酶,能降解细胞外基质,金属蛋白酶抑制剂则能抑制其活性,这两组酶在很多瘤组织中表达增高.文章就基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达与肿瘤的关系及在淋巴瘤方面的最新研究进展做了综述.     

重组毕赤酵母表达reteplase发酵过程中的降解现象

研究了pH和温度对重组毕赤酵母表达retep lase(rPA)发酵过程中的降解现象。在低pH(4.5)诱导条件下,由于蛋白酶活性高,rPA降解严重,表达量几乎为0,提高诱导pH至6.5,蛋白酶活性降低,rPA的表达量最高达到122 m g/L。通过将诱导温度从30°C降低到20°C,rPA的表达量从153.2 m g/L提高到207.9 m g/L。降低温度能减少细胞死亡率,从而减少了发酵液中蛋白酶的释放,降低了蛋白酶的活性,抑制了对目的蛋白rPA的降解。另外,低温使胞内AOX酶活性提高,从而增强了rPA的表达。     

枯草芽孢杆菌YYW-1蛋白酶缺陷株诱变与筛选

从羽毛废弃物中筛选出一株高效降解羽毛、产角蛋白酶和蛋白酶的革兰氏阳性芽孢杆菌,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus sublitis),命名为B.sublitisYYW-1。利用紫外线对菌株YYW-1进行诱变,筛选蛋白酶缺陷株,获得蛋白酶活性丧失的诱变株YYW-1-5,其蛋白酶活性残余22.7%,而角蛋白酶活性残余94.7%,没有明显的变化。     

鲨鱼皮胶原蛋白肽成分分析

应用植物蛋白酶和动物蛋白酶来处理酶解鲨鱼皮,通过现代生物化学方法分离制备鲨鱼胶原蛋白肽,并对其组成成分进行分析,测定了它们的粗蛋白、粗脂肪、灰分、氨基酸及Cu、Zn、Fe、Ca 、Na、K、Pb等金属元素的含量.应用MALDI-TOF分析两种胶原蛋白肽分子量的分布范围.结果表明,植物蛋白酶酶解方法研制的胶原蛋白肽分子量分布范围在2～3 ku区间,而用动物蛋白酶酶解方法研制的胶原蛋白肽分子量分布范围在2～7 ku区间.     

真鲷肌肉蛋白的分解及影响因素

研究了真鲷死亡后肌肉蛋白在不同条件下的分解情况,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹法对结果做鉴定分析,结果表明,当温度为25℃时,肌肉蛋白的分解作用不明显,温度超过40℃时,肌肉蛋白尤其是肌球蛋白重链（MHC）的分解显著;盐浓度的增加有利于MHC的分解,表明盐溶性蛋白MHC中的蛋白酶酶切位点随盐浓度的提高而更多暴露,易受蛋白酶的攻击;钙离子浓度变化对分解作用影响不大;即使在70℃下,无论是肌浆蛋白还是肌原纤维蛋白其分解作用仍很明显,表明参与分解作用的蛋白酶有高度热稳定性且在肌浆和肌原纤维中均有存在．