纳米化阿苯达唑对细粒棘球蚴原头节生长的影响

目的观察比较阿苯达唑粉剂和纳米化阿苯达唑在体外对细粒棘球蚴原头节作用的影响。方法将阿苯达唑粉剂溶解于DMSO后与纳米化阿苯达唑分别配成3.13、6.25、12.5、25μg/m L浓度,按照所设分组体外培养,倒置显微镜下观察各药物处理组经伊红染色后原头节的形态及活力。ELISA试剂盒测定药物作用3、6 d后原头节体内抗氧化酶NQO-1的活性变化。结果将相同条件下阿苯达唑粉剂和纳米环阿苯达唑各浓度组原头节的活力较空白对照组降低。12.5、25μg/m L浓度组纳米化阿苯达唑酶活性变化高于阿苯达唑粉剂组。结论阿苯达唑粉剂和纳米阿苯达唑均有不同程度的体外抗细粒棘球蚴原头节作用;纳米化阿苯达唑在体外抑制细粒棘球蚴原头节生长作用优于普通阿苯达唑粉剂,有望成为治疗细粒棘球蚴病的一种新的剂型。     

鹅脱氧胆酸诱导细粒棘球蚴原头节凋亡作用机制的初步研究

目的初步探究鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)诱导细粒棘球蚴原头节凋亡的作用机制。方法采用鹅脱氧胆酸体外处理细粒棘球蚴原头节,0.1%伊红染色,倒置显微镜观察原头节的活力;Caspase-3试剂盒检测其酶活性变化;采用DCFH-DA染色法利用荧光酶标仪检测鹅脱氧胆酸作用2、4 d后原头节内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的荧光强度的变化;western blot技术检测Nrf2蛋白的表达;生物化学法测定细胞中谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)和硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase,TPx)酶活性的变化。结果体外应用500、1000、2000、3000μmol/L鹅脱氧胆酸能够抑制原头节体外生长,随着时间的延长,抑制作用逐渐增强;不同浓度鹅脱氧胆酸作用原头节24、48 h后caspase-3酶活性升高,随着时间的延长caspase-3酶活性增加越明显;不同浓度鹅脱氧胆酸作用原头节2、4 d后观察到原头节内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的水平升高(F=1631.77,P0.05),同时western blot检测发现Nrf2蛋白的表达降低(P0.05),并检测到抗氧化物酶谷胱甘肽过氧化物酶(F=756.033,P0.05)和硫氧还蛋白过氧化物酶(F=608.848,P0.05)的活性降低。结论鹅脱氧胆酸诱导细粒棘球蚴原头节凋亡可能是通过氧化应激途径起作用。     

体外长期培养细粒棘球蚴原头蚴生长发育规律的研究

目的探讨总结体外连续培养细粒棘球蚴原头蚴生长发育的规律。方法在5%CO2培养箱中37℃条件下,以RPMI-1640为基础培养基含20%胎牛血清的单相培养体系中体外培养原头蚴,在倒置显微镜下定期动态观察原头蚴的体积及形态学变化,计算其成囊率、蒂端发泡形成率等指标随时间变化情况,总结其体外培养生长发育规律。结果体外培养原头蚴在第1周开始形成蒂端发泡,在体外培养的前6周,原头蚴的形态学以蒂端发泡为主要变化特征,其数量逐渐增加,体积逐渐增大。第5周可观察到原头蚴外周形成一层角质层,开始向成囊方向发育;原头蚴的体积随培养时间的延长逐渐增大,观察到最大囊的直径约为:1.2mm,在体外培养的第17周部分原头蚴囊外周的角质层开始变得毛糙,囊的体积缩小,其内部结构变得模糊不清,浓缩聚集成团,与外周的角质层有明显的界限,培养至7个月时,90%以上的囊泡出现上述形态学改变;原头蚴的最大成囊率约为11%。结论 1、体外培养原头蚴的体积随培养时间的延长存在从小到大再逐渐缩小的规律;2、体外培养原头蚴在成囊发育过程中可出现多种不同的形态学变化,是否存在多种成囊方式还需要进一步验证。     

细粒棘球绦虫新疆株胆汁酸钠协同转运蛋白基因的克隆及序列分析

 从新疆株细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)原头蚴中克隆胆汁酸钠协同转运蛋白(sodium-bile acid co-transporter,EgSBACT)基因,进行序列测定和生物信息学分析。首先设计EgSBACT 基因特异性引物,用RT 及PCR 方法从新疆株细粒棘球绦虫原头蚴提取总RNA,将其反转录成cDNA 后扩增EgSBACT 基因并将其克隆至原核表达载体pET30a 中,测序鉴定序列并进行生物信息学分析。结果显示,RT-PCR 扩增出一长度约650 bp 的基因,测序显示其长度为654 bp,序列与Gen-bank 公布的EUB59978.1 完全一致,其编码217 个氨基酸,预测其等电点为9.28。同源性分析发现,EgSBACT 蛋白序列与中华枝睾吸虫SBACT(GenBank:GAA57409.1)同源性最高,达到43%。进化树分析表明,细粒棘球绦虫的SBACT 蛋白与吸虫纲的SBACT 相聚集,在进化树上处于一枝,而与其他物种亲缘性较远。由此表明,本研究成功克隆出细粒棘球绦虫EgSBACT 基因。     

胆汁对体外培养人细粒棘球蚴原头蚴生长发育的影响

目的探讨胆汁对体外培养人细粒棘球蚴原头蚴生长发育的影响。方法将人细粒棘球蚴原头蚴分别加入纯胆囊胆汁组(Ⅰ组)、RPMI-1640+肝内胆汁(2:1)组(Ⅱ组)及RPMI-1640组(Ⅲ组)中体外孵育。0.1%伊红染色在倒置显微镜下观察原头蚴的形态变化、活动度、顶泡形成情况、头节外翻及成囊发育等生长情况。结果Ⅰ组中95%原头蚴在第9天其外观及内部结构完全破坏;其在胆汁的刺激下第1天活动度达60%,约过半数的头节外翻,随着作用时间的延长,在第7天活动度逐渐降低,原头蚴在第6天后其头节外翻处于停滞状态,大部分原头蚴死亡。Ⅱ组中80%原头蚴在第14天仍能观察到清晰的外观及内部结构;该组原头蚴的活动度在第7天开始下降;头节外翻率随培养时间的增加逐渐增加。Ⅲ组中的原头蚴第14天仍可观察到具有较好的外观及清晰的内部结构;活动度随培养时间的延长而逐渐增加;该组中的原头蚴在第4天开始出现顶泡并随时间的延长出现顶泡的原头蚴数量逐渐增加;头节外翻率逐渐增加。通过连续培养观察,Ⅰ组中的原头蚴无成囊发育;Ⅱ组培养的大部分原头蚴体积缩小,头节内陷,仅少量培养的原头蚴成囊发育,大部分原头蚴随培养时间的延长走向死亡;Ⅲ组中原头蚴逐渐向囊方向发育,且数量逐渐增多。结论 (1)纯胆汁不能在短时间内灭活原头蚴,但随着作用时间的延长原头蚴的活性降低;(2)胆汁可以抑制原头蚴的成囊发育,但在胆汁存在环境下仍有原头蚴成囊。     

细粒棘球蚴重组蛋白14-3-3和Eg10免疫差异的初步研究

表达纯化细粒棘球蚴重组蛋白14-3-3(rEg14-3-3)和Eg10(rEg10),分别免疫小鼠,8w后进行细粒棘球蚴原头蚴攻击感染.计算免疫保护力,检测脾组织中CD4+T、CD8+T细胞亚群以及T细胞增殖情况.实验结果表明,rEg14-3-3免疫组小鼠具有85.3%抵抗细粒棘球绦虫感染的能力,而rEg10免疫组小鼠与对照组小鼠相比无免疫保护力;与PBS对照组相比,只有rEg 14-3-3免疫组的CD4+T细胞亚群的分布有明显差异,且rEg 14-3-3抗原能诱导淋巴细胞显著增殖.因此rEgl4-3-3蛋白能抑制细粒棘球蚴的生长,诱导小鼠产生高水平的免疫保护力,可作为疫苗候选分子.     

多频聚焦超声波对细粒棘球蚴囊壁药物通透性的影响

将人工接种感染的小鼠腹腔细粒棘球蚴包囊90个,随机分为A~E 5组,分别用多频聚焦超声不同功率和组合方式进行超声照射.多频聚焦超声辐照后的各组包囊置于含1 00μg/mL阿苯达唑的RPMI 1640培养液中,经不同时间培养后,高效液相色谱法测定细粒棘球蚴囊内的药物质量浓度,以评价不同功率及辐照次数、辐照后含药培养液中不同培养时间对囊壁药物通透性的影响.结果显示:多频聚焦超声照射可以改变细粒棘球蚴囊壁的药物通透性.三频联合与单频相比,以及两次以上照射与单次照射相比,细粒棘球蚴囊内药物质量浓度差异均具有统计学意义.照射后包囊继续在含药培养基中培养,可进一步提高囊内药物质量浓度.本研究证实多频聚焦超声照射可使细粒棘球蚴囊壁药物通透性持续增加.多频联合超声作用的效果明显优于单频、多次照射优于单次照射.多频多次照射、适当延长包囊在药物中的培养时间能够最大程度地提高囊内药物质量浓度.     

大肠埃希菌对细粒棘球蚴活性影响的体外研究

目的 研究细粒棘球蚴与特定浓度大肠埃希菌体外共培养的条件下活性、形态随时间的变化，以及部分参与通路。方法 将羊源性原头蚴重悬计数，分为空白组、0.5麦氏浓度大肠埃希菌组(实验组),并以12、24、48、72、96 h为时间节点，使用0.1%伊红染液按照体积1∶1的比例染色2 min后显微镜下观察并计算两组原头蚴的存活率；使用活性氧试剂盒在上述时间点检测两组原头蚴体内ROS水平；在12、48、96 h分别检测Caspase-3、9;Bax、Bcl-2、Nrf2蛋白的表达水平。结果 实验组原头蚴存活率随时间延长降低，在96 h降至为0%;两组原头蚴体内活性氧检测显示：实验组ROS水平明显提高，12 h最高，差异具有统计学意义(T=11.638,P<0.05),在72 h ROS水平与空白组相近；Western blot实验表明，凋亡蛋白Bax(T=4.997,P<0.05)、Caspase-3蛋白(T=6.118,P<0.05)、Caspase-9蛋白(T=3.435,P<0.05),实验组的蛋白水平大于空白组，有统计学意义。抗凋亡蛋白Bcl-2,实验组的蛋白水平小...     

多巴胺对海马神经元树突和突触形态的调节作用

为探讨多巴胺(dopamine,DA)对海马神经元树突和突触形态的影响及其机制,用体外培养10 d的海马神经细胞DA(0.1μmol/L～10 mmol/L)处理1 h,用绿色荧光标记突触前Syn1,红色荧光标记树突上F-actin,分别显示突触前和突触后树突棘位点,红绿色叠加的黄色区域标示突触.结果表明:1～100μ...     

细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为了表达、纯化细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白及制备多克隆抗体,本研究构建细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白原核表达载体p ET30a-M26,转化至大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达,SDS-PAGE切胶纯化的副肌球蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,并用Western blotting和ELISA对副肌球蛋白及抗体进行检测。结果显示:成功表达并纯化了细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白,重组蛋白分子质量约41 k D,纯化后目的蛋白纯度可达85%,蛋白浓度为0.5mg/ml。副肌球蛋白可与所制备的多克隆抗体结合,ELISA测定的抗体效价为1∶12800,结果表明,成功表达并纯化了六钩蚴副肌球蛋白。本研究可为研究包虫病早期诊断奠定了基础。     

肝包虫96例诊治体会

肝包虫病是流行于畜牧业为主地区的一种常见的人畜共患性寄生虫病.是由于寄生于犬消化道的绦虫(细粒棘球绦虫)的蚴侵人人体肝脏内所致.有较明确的地域性,在我国以新疆、内蒙、青海、西藏、四川西北较为多见.人肝包囊虫病的患病率达0.5%-5.0%,感染率达3.1%-31.5%,目前对该病尚无有效的药物治疗,确诊后需要手术治疗.我...     

细粒棘球蚴囊液抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应

目的 观察细粒棘球蚴囊液对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7分泌炎性因子的影响,并探讨其可能的机制。方法 培养小鼠巨噬细胞,分为四组处理：对照、囊液(2.15 mg·mL^-1)、LPS(1μg^-1mL^-1)以及LPS+囊液。刺激5 h后,qRT-PCR检测TNF-α、IL-6和IL-10的表达;刺激1 h后,免疫印迹法检测STAT3和p-STAT3的蛋白水平。结果 囊液能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中IL-6和TNF-α的mRNA表达,却明显促进IL-10的表达。进一步发现囊液能促进STAT3信号的活化水平,而当使用STAT3的抑制剂S3I-201后,STAT3的磷酸化水平明显降低,同时回升了TNF-α的表达。结论 细粒棘球蚴囊液能抑制RAW264.7细胞炎症反应,IL-10/STAT3信号通路可能参与调控此过程。     

不同诱导条件对树鼩骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的 探讨不同诱导条件对树鼩骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）体外向成骨细胞分化的影响。方法 取 P3代树鼩骨髓间充质干细胞分成7组进行诱导。A组：高糖DMEM+1μmol/L地塞米松+100μmol/L维生素C+10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠;B组：高糖 DMEM+50 ng/mL BMP-2;C组：高糖 DMEM+80 ng/mL BMP-2;D组：高糖DMEM+50μmol/L维生素C+10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠+20ng/m L BMP-2;E组：高糖 DMEM+1μmol/L地塞米松 +100μmol/L维生素C+20 mmol/Lβ-磷酸甘油钠;F组：高糖DMEM+100μmol/L地塞米松+100μmol/L维生素 C+10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠;G组：DMEM/F12+0.1μmol/L地塞米松 +50μmol/L维生素C+10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠。诱导18 d后进行碱性磷酸酶和茜素红染色鉴定其诱导分化情况。结果 每一组碱性磷酸酶染色呈不同程度的阳性,茜素红染色可在A、B、C、D和E组观察到明显矿化结节。结论 A组、B组、C组、D组和 E组可以诱导树鼩BM-MSCs向成骨细胞分化,其中以A组和B组效果最为突出。     

石蒜碱对人胃癌细胞体外增殖的影响

以体外培养的h GCCs MGC-803细胞系为研究对象,采用不同浓度石蒜碱(5、2.5、1.25μmol/L)进行处理,倒置显微镜下观察其生长状态,同时采用血球计数板统计其体外增殖率,采用流式细胞技术检测处于不同细胞周期的细胞比例.结果表明,石蒜碱处理对h GCCs的体外增殖具有一定的抑制作用,其中5μmol/L石蒜碱对h GCCs的抑制作用最为明显.显微观察和计数分析结果表明,5μmol/L石蒜碱处理的h GCCs活力最低,细胞凋亡现象最明显.细胞周期检测的结果显示石蒜碱处理会使h GCCs增殖趋缓,细胞周期延长.     

Exendin-4高活性短肽模拟物的筛选及生物活性

以细胞表面胰高血糖素样肽(GLP-1)受体为靶标,利用噬菌体筛选技术,通过Exendin-4竞争性洗脱筛选GLP-1受体激动剂,得到了12肽模拟物EPA.细胞增殖实验结果表明:EPA和Exendin-4均可促进胰岛β细胞增殖活性,在40～200μmol/L内,EPA比Exendin-4的活性高5%～25%;在100mmol/L高浓度葡萄糖毒性下,EPA通过抑制bax基因和上调bcl-2基因表达及抑制Caspase-3活性来抑制胰岛β细胞的凋亡;EPA是具有高活性的Exendin-4短肽模拟物,可通过bcl-2/bax…Caspase-3信号通路抑制线粒体的凋亡.     

D-葡萄糖脱氢酶活力测定方法的研究 ——短小芽孢杆菌在D-核糖生产中的应用

D-核糖发酵液离心洗涤得菌体,采用超声波破碎(在40kW下,工作4s,间歇4s,破碎90次),制备无细胞抽提液.取无细胞抽提液80μL及100μmol/L葡萄糖、4μmol/LNADP、0.6mmol/LTris-HCl(pH＝6.8)、10μmol/LMnSO4溶液各1mL,在37℃下保温10min,测定A340num的值,对比NADPH标准曲线,测定D-葡萄糖脱氢酶的酶含量.根据测定的时间及酶蛋白的含量,从而确定D-葡萄糖脱氢酶的酶活力的测定方法.     

绵羊卵母细胞不同cAMP水平模型的构建

环腺苷酸(cAMP)是维持哺乳动物卵母细胞减数分裂停滞的关键分子.本试验利用ELISA和地衣红染色技术,检测了西洛酰胺(Cilostamide)与乌药醚内酯(Linderane)对绵羊卵母细胞和卵丘细胞内cAMP水平以及生发泡破裂(GVBD)的影响.结果显示:体外培养3h后,10μmol/L Cilostamide和5μmol/L Linderane分别能显著提升和抑制卵母细胞而非卵丘细胞内的cAMP水平;体外培养6h后,Cilostamide组卵母细胞GVBD率(14.91%)显著低于对照组(34.45%)与联合添加组(33.47%)(P0.05),而Linderane组与其相反,表明不同cAMP水平卵母细胞模型构建成功.     

外源Ca对Cd胁迫下旱柳Cd吸收、亚细胞分布和化学形态的影响

为了探究外源Ca对植物抗Cd胁迫能力的影响,以旱柳(Salix matsudana L.)为实验材料,利用水培方式进行培养,测定不同处理组(50 mmol/L Ca、50μmol/L Cd、50 mmol/L Ca+50μmol/L Cd)中旱柳培养7、14、21、28 d后的Cd、Fe、Mn的含量,同时检测了培养7 ...     

红豆杉细胞聚集体悬浮培养生产紫杉醇

建立了中国红豆杉(Taxuschinensis)细胞聚集体两步法悬浮培养生产紫杉醇的培养体系.红豆杉细胞于含LH1g/L,NAA0.1mg/L,2,4-D0.5mg/L及6-BA0.8mg/L的细胞聚集体形成的培养基中生长并形成聚集体,10d后转入生产培养,较大细胞聚集体的生物量比和紫杉醇产量分别较对照组提高了53.7%和82.1%;提高细胞聚集体的生物量比能显著增加紫杉醇产量.四种基本培养基中B5最适合诱导细胞聚集体的形成.生长培养12d后细胞悬浮培养物按1∶1(体积比)直接转入生产培养对细胞生长、细胞聚集体和紫杉醇形成最有利.在100μmol/L茉莉酸甲酯作为诱导子下本体系紫杉醇产量较对照组提高了一倍.     

促减数分裂甾醇（MAS）对猪卵母细胞体外成熟及其胚胎发育能力的影响

利用促减数分裂甾醇(MAS)合成代谢过程中的抑制剂AY9944累积FF-MAS的原理,在猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944,间接地研究了内源性MAS对猪卵母细胞体外成熟质量的影响.猪卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)培养在NCSU23成熟培养液中,并添加不同浓度(0,10,20,40μmol/L)的AY9944培养44h.培养结束后,成熟的卵母细胞进行孤雌激活和以胎儿成纤维细胞为核供体重构胚胎,分别于48和144h观察胚胎发育情况,统计卵裂率和囊胚率及囊胚/2-细胞胚比率.结果如下:(1)随着AY9944添加浓度的增加,退化的卵母细胞增多,40μmol/L AY9944处理的退化卵显著,卵母细胞成熟率显著下降.(2)成熟培养液添加20和40μmol/L AY9944处理的孤雌激活胚胎的囊胚形成率和2-细胞胚发育到囊胚的比率显著增加(P<0.05).(3)以对照组(0μmol/L AY9944)和20μmol/L AY9944处理的卵母细胞为胞质受体,发现20μmol/L AY9944处理的克隆胚的发育能力囊胚率和2-细胞胚发育到囊胚的比率有所提高,但无显著差异(P>0.05).以上结果表明,猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944提高了猪卵母细胞体外成熟的胞质质量,胚胎的发育能力提高.