毕赤酵母表达Neuritin蛋白的纯化及鉴定

为研究重组Neuritin的毕赤酵母表达蛋白的纯化方法及鉴定。应用甲醇诱导GSll5/pPIC9K-Neuritin毕赤酵母工程菌株表达Neuritin蛋白,采用硫酸铵盐析、His-Trap Crud亲和层析等方法,对该表达产物进行纯化。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE、western-blot和生物质谱鉴定。结果显示,SDS-PAGE分析显示经甲醇诱导后表达的蛋白获得了与Neuritin分子量理论值相符的条带,western-blot分析它能够与抗表位抗体特异反应,进一步生物质谱分析证实该纯化重组蛋白为Neuritin重组蛋白。由此可知,本研究建立了一种有效的纯化方法,获得高纯度的Neuritin重组蛋白,为大量制备Neuritin纯化蛋白,开展其功能和机制研究奠定基础。     

Neuritin野生型蛋白的制备及活性、稳定性的检测及分析

目的 制备符合药典结构要求的无标签Neuritin野生型(wild type,WT)蛋白,并完成其存在形式、活性及稳定性鉴定及分析。方法 利用基因重组技术构建符合药典结构要求的Neuritin WT酵母重组子,利用SDS-PAGE还原电泳及Western blot对其进行高表达筛选及鉴定;摸索建立无标签Neuritin WT蛋白纯化方法,对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE还原电泳分子量鉴定、Western blot免疫原性鉴定、SEC-HPLC精细鉴定及宿主DNA、宿主蛋白残留量检测;利用SDS-PAGE非还原电泳完成存在形式的鉴定;通过参照药典建立的重组Neuritin蛋白活性鉴定方法,检测并分析Neuritin WT纯化蛋白的活性,并观察37℃下不同时间Neuritin WT纯化蛋白的稳定性。结果 制备了纯度高达98%以上的Neuritin WT纯化蛋白,蛋白相对分子质量为9.7 kDa,宿主DNA残留量为0.009 4 ng/剂,宿主蛋白残留量占比0.000 8%;经检测,该纯化蛋白存在单体、二聚体2种形式。活性鉴定结果表明该蛋白具有维持神经元存活的生物学活性;且37℃下3 d内...     

毕赤酵母表达人Neuritin蛋白的条件优化、纯化及鉴定

对毕赤酵母表达重组Neuritin蛋白的产物进行了纯化和鉴定,并进行了细胞毒性的量效关系的研究,为进一步应用于动物模型的实验研究奠定基础。应用甲醇诱导毕赤酵母工程菌株GS115/pPIC9K-rhNeuritin表达Neuritin蛋白,对甲醇诱导的浓度和时间进行了优化。表达产物经Ni-NAT纯化和透析浓缩,进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定,将纯化产物用于体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞,对Neuritin蛋白与细胞存活的量效关系进行了研究。条件优化的结果显示,1%甲醇浓度诱导表达96h时,Neuritin蛋白表达量最大,可达0.48mg/mL。SDS-PAGE确定了表达产物分子量的大小,约为11kda;Western-blot证实表达产物为Neuritin;进一步的细胞毒性实验显示,纯化后的Neu-ritin蛋白在2.5μg/mL的浓度比较适合细胞生存。毕赤酵母高效分泌性表达了人Neuritin蛋白,经过镍柱亲和层析得到了有效的纯化,其发挥生物学作用的蛋白浓度为2.5μg/mL。     

真核表达肝药酶UGT1A9可溶重组蛋白方法探索

UDP-葡萄糖醛酸基转移酶(UGTs)是人体重要的肝脏药物代谢酶,其底物选择性、催化机制等研究因难以获得可溶性全酶而受到限制.本研究以制备UGT1A9可溶重组蛋白为研究目标,通过筛选重组蛋白表达体系、融合标签种类及linker长度,优化重组蛋白表达纯化条件和方法,实现了重组UGT1A9的大量制备.HEK293F细胞分泌表达的His₈-MBP-NSAS-UGT1A9(氨基酸25-466)重组蛋白经Ni-TED亲和纯化介质从培养基上清液中分离,洗脱产物经SDS-PAGE、Western blot及MS检测鉴定为目的蛋白,通过Bradford法测得重组蛋白最终产量为2 mg/L,纯度达到95%以上.本研究建立了一种人源药物代谢酶UGT1A9的可溶重组蛋白表达纯化方法,为UGT1A9及UGTs同工酶的药物代谢、催化机制及结构解析研究奠定基础.     

大鼠Neuritin mRNA鉴定、编码序列及蛋白结构分析

为探讨一种新型的神经营养因子,Neuritin在神经系统成熟及其损伤后的再生修复过程中发挥着重要的调节作用。为了获得大鼠Neuritin基因转录本及其蛋白结构的基础数据,本研究利用比较基因组学分别设计与小鼠2个转录本同源的引物,采用RT-PCR的方法钓取大鼠Neuritin基因。采用生物信息的方法对大鼠Neuritin的序列同源性及蛋白结构进行全方位分析。结果表明,大鼠只存在一个Neuritin转录本,编码142个氨基酸,与其他动物的编码序列高度同源;三级蛋白结构分析结果显示大鼠Neuritin蛋白富含有α螺旋,其结构和理化性质无异于人类Neuritin基因。由此可知,本研究首次厘定了大鼠Neuritin mRNA,其蛋白质结构的深入分析也为进一步理解大鼠Neuritin基因的生理功能奠定了基础数据。     

neuritin基因杆状病毒表达载体的构建

为研究Neuritin蛋白的功能,将neuritinORF在杆状病毒-昆虫表达系统中表达,构建杆状病毒表达载体.以308D10为模板,利用PCR方法扩增neuritinORF,定向克隆法将其克隆至PFASTBAC-HTA转移载体中.然后利用同源重组原理将其转移至杆粒bacmid中.得到携带neuritin ORF的重组杆粒.本实验获得了重组目的基因真核表达载体并经PCR鉴定,插入片段方向、大小正确,DNA测序分析表明插入处接头和读框与预期序列相符,成功构建了Neuritin的杆状病毒表达载体.     

重组人血管内皮生长因子165在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化与体外活性评价

人血管内皮生长因子165(VEGF165)可有效促进血管新生和增加血管通透性,在伤口愈合方面有重要医疗价值。建立获取高纯度、高活性的优质重组VEGF165蛋白的方法具有重要意义。研究利用带有6组氨酸标签的二硫键形成蛋白A(Dsb A)的E.coli表达系统实现了Dsb A-VEGF165融合蛋白的可溶性表达;诱导过程中添加5%(v/v)的乙醇可显著提高工程菌中可溶性融合蛋白表达水平。融合蛋白通过Ni亲和层析粗纯,并经牛肠激酶酶切去除标签蛋白。随后利用肝素亲和层析精纯获得重组人VEGF165蛋白。非还原及还原SDS-PAGE电泳检测到分子量为约40 k Da的同源二聚体蛋白,促HUVEC细胞增殖实验显示重组蛋白具有较优的活性,EC50为13 ng/m L。研究实现了Dsb A-VEGF165的在E.coli中可溶性表达,建立了经济、高效的纯化方法,获得了高质量、高活性的重组人VEGF165蛋白。     

人转化生长因子β1在大肠杆菌RR1中的表达及产物纯化

目的：构建能高效表达人转化生长因子β1的基因工程菌,优化产物分离纯化的条件,方法：用PCR方法扩增人转化生长因子β1的cDNA,将该cDNA片段插入经改造的pBV220表达载体pBL2的表达框架中,构建了表达菌株RR1／pBL－2－TGF－β1．42℃温控诱导表达,采用谷胱甘肽法,对重组蛋白进行复性。通过阳性离子交换、变性分子筛层析纯化重组蛋白,用MTT法测定重组蛋白的活性。结果：所构建的表达菌株,其TGF－β1的表达量约为15％,重组蛋白的复性率达到30％,经纯化获得了银染一条带的重组蛋白,测活表明和理级具有较强的生物活性。结论：人转化生长因子β1在大肠杆菌RR1中实现了高效表达,获得了具有生物活性的重组TGF－β1。     

大黄鱼源杀香鱼假单胞菌外膜蛋白OmpA的原核表达及免疫原性分析

外膜蛋白A(OmpA)是革兰氏阴性菌主要的外膜蛋白之一,在多种致病菌中表现出较强的免疫原性,是具有潜力的候选疫苗。为分析大黄鱼内脏白点病病原杀香鱼假单胞菌OmpA类外膜蛋白的免疫原性,本研究选取了杀香鱼假单胞菌基因组中存在的3个OmpA类重组蛋白(依次命名为P1,P2,P5,Genbank收录号分别为EPB94769.1,EPB94930.1,EPB95835.1),通过构建pET30a-OmpA表达载体、转化BL21诱导表达、His标签纯化等技术,获得3个纯化的OmpA类重组蛋白,分子量大小依次为25 kD(P1),32 kD(P2),35 kD(P5)。用制备的新西兰兔抗杀香鱼假单胞菌多克隆抗体,对获得的纯蛋白进行免疫原性Western Blot检测,结果表明:重组蛋白P1,P2,P5均能与兔抗发生特异结合,结合强度P5P2P1。本研究首次获得了杀香鱼假单胞菌OmpA重组蛋白并初步鉴定了其免疫原性,为杀香鱼假单胞菌的疫苗设计和筛选提供了有益参考。     

牛乳铁蛋白活性多肽LfcinB在大肠杆菌中的串联表达、纯化及生物活性分析

牛乳铁蛋白(LfcinB)是一种阳离子抗菌肽,具有抗细菌、抗肿瘤等多种生物学活性.本文探讨了利用SUMO(Small Ubiquitin-Related Modifier)融合标签在大肠杆菌系统中通过LfcinB串联表达策略制备重组LfcinB的方法.结果显示,大于90%的SUMO-(LfcinB)_n蛋白以可溶形式表达于BL21(DE3)细胞中;SUMO-(LfcinB)_2的表达量高于SUMO-LfcinB和SUMO-(LfcinB)_3.通过SUMO特异性蛋白酶切除SUMO标签,羟胺释放单体,得到纯化的重组LfcinB,产率约为15 mg/L.生物活性结果表明,重组LfcinB具有一定的抗菌和抗肿瘤活性.本研究为结合SUMO标签与串联表达策略大量制备获得具有生物学功能的重组抗菌肽提供了一种有效的方法.     

莱茵衣藻IFT139蛋白抗原的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

IFT139是莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)纤毛内运输蛋白IFT复合物A中的一个重要组分.其编码基因的突变、缺失或沉默将会影响纤毛正常的组装和解聚,进而导致纤毛病的产生.为深入研究IFT139的作用机制,本实验首先PCR获得ift139 5′端458 bp的EST片断,成功构建了p MAL-c2-ift139与p ET-28a(+)-ift139重组质粒.然后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,分别得到相对分子质量为6.0×104和2.5×104的重组MBP/HIS-IFT139融合蛋白.进一步将亲和纯化的MBP-IFT139融合蛋白(纯度95%,以上),免疫新西兰大白兔获得抗血清,间接ELISA法测得血清效价为1﹕256,000.最后将抗血清依次经Protein A和硝酸纤维素膜纯化后,用Western blot检测抗体特异性,结果显示所制备抗体能够正确特异性识别莱茵衣藻中的IFT139,从而为IFT139作用机制的阐明和纤毛相关疾病的研究奠定了重要基础.     

人源程序性死亡配体PD-L2蛋白的原核表达与抗血清制备

利用原核表达系统获得包涵体表达形式的重组蛋白h PD-L220~123(Ig V结构域)和h PD-L220~208(Ig V结构域和Ig C结构域);将重组蛋白利用Ni-NTA柱亲和层析纯化与复性后,作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠制备鼠抗人的多抗血清,经ELISA法检测其效价均达到1∶106;Western-blot实验结果表明,制备的多抗血清均能特异性识别h PD-L2蛋白.以制备的多抗血清进行IHC实验评估与鉴定,结果显示:以h PD-L220~123重组蛋白为免疫原制备的多抗血清阳性较弱且定位模糊,以h PD-L220~208重组蛋白为免疫原制备的多抗血清具有很强的膜定位且背景清晰.     

卵形鲳鲹TNFSF6的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备

为了研究卵形鲳鲹肿瘤坏死因子配体6(TNFSF6)的功能,本研究构建了TNFSF6的原核表达载体并制备了其多克隆抗体,首先通过PCR扩增技术扩增获得了TroTNFSF6的开放阅读框序列,并构建了原核表达重组质粒pET-TroTNFSF6,随后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21中,进行原核表达并获得重组蛋白rTroTNFSF6.结果显示,重组蛋白rTroTNFSF6大小约46.5 kDa,其最适诱导温度为20℃,诱导时间为8 h,IPTG的最佳浓度为0.6 mmol/L.可溶性分析表明,重组蛋白rTroTNFSF6主要在沉淀中,以包涵体的形式存在.将纯化后的重组蛋白rTroTNFSF6免疫小鼠以制备多克隆抗体,ELISA检测结果表明其效价高达1∶32 000.本研究为进一步探究卵形鲳鲹TNFSF6的功能奠定了基础.     

中华鳖抗嗜水气单胞菌亚单位疫苗的制备与应用

水体条件致病菌嗜水气单胞菌对中华鳖养殖业的危害巨大.为预防嗜水气单胞菌的感染,提高中华鳖免疫抵抗力,研究开发嗜水气单胞菌疫苗是一种有效的方法.利用PCR手段克隆获得嗜水气单胞菌DnaK和DnaJ两个基因,并将两基因重组到大肠杆菌表达载体上,转化至大肠杆菌表达菌株,纯化获得了重组蛋白rDnaKAh和rDnaJAh.将两个重组蛋白分别与弗氏佐剂充分混合制备成疫苗,腹腔注射中华鳖幼鳖,加强免疫一次后,用已分离获得的致病菌株感染中华鳖幼鳖,实验结果表明rDnaK具有81.8％的免疫保护效应,而rDnaJ仅具有31.8％的免疫保护效应.     

毛竹DNA的纯化和检定

<正> 要从事DNA分子的转化、重组及表达等方面的研究,首先须获得一定纯度和天然态的DNA分子,而且要求纯化DNA的方法简易有效。 六十年代Marmur等人介绍了一个制备具有转化活性的DNA方法,但步骤多,操作烦。1969年Bernardi报道了用羟基磷灰石柱层析方法分离纯化了小牛胸腺DNA,获得了天然态的DNA分子。 本试验用高氯酸钠法从毛竹笋中制得DNA粗制品,通过羟基磷灰石(HA)柱层析分离、纯化,获得了纯净的双链DNA。是一种简易而有效的纯化DNA的方法。 材料和方法 1.毛竹(Phyllostachys pubescens)取25厘米高的竹笋,去箨,切成小块,用SSC洗涤两次,贮存在冰箱的冰隔层内,预冷24小时。 2.羟基磷灰石 按照上海生物化学研究所代谢调节控制组(1976)所述方法自行合成。     

抗肺炎链球菌工程多肽的制备研究

目的:制备和纯化抗肺炎链球茵工程多肽(Ph-SP).方法:将重组质粒转化入工程茵TGl表达工程多肽,经透析、离子交换柱纯化后,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白,微平板法测定蛋白浓度.结果:经透析、离子交换柱纯化后可获得较为单一的目的蛋白,蛋白浓度为0.18mg/ml.结论:本文的操作流程可以获得相对单一的目的蛋白.     

哈维氏弧菌vgrG基因的原核表达及多克隆抗体的制备

VI型分泌系统(T6SS)是革兰氏阴性菌特有的一种多功能分泌系统,它与致病菌的致病性密切相关;而vgrG则是T6SS系统的结构蛋白之一,它与T6SS的功能直接相关.为了获得哈维氏弧菌vgrG基因的外源重组蛋白及制备其多克隆抗体,本研究以哈维氏弧菌QT520菌株的DNA为模板,在扩增获得vgrG基因后,构建了原核表达载体pET32a-vgrG并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达.结果显示,在16℃和1mmol·L^-1 IPTG诱导20 h的条件下,可诱导重组蛋白rvgrG大量表达,条带大小与预期的分子量(88 kDa)一致;通过Ni²⁺亲和层析柱对融合蛋白rvgrG进行纯化,获得了纯度较高的目的蛋白rvgrG;将rvgrG重组蛋白通过腹腔注入小鼠体内后观察其毒性,结果显示rvgrG对小鼠无毒害作用;进一步用纯化蛋白rvgrG制备多克隆抗体,经ELISA检测,vgrG多克隆抗体的效价高达1∶320 000;蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明,本实验所制备的vgrG多克隆抗体特异性强,可为后续进行vgrG蛋白的致病性及致...     

重组金针菇免疫调节蛋白的纯化及生物活性研究

目的研究重组的金针菇免疫调节蛋白(re FIP-fve)对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用、诱导小鼠脾淋巴细胞对白细胞介素-2(IL-2)的促分泌作用及对血细胞的凝集作用.方法采用离子交换色谱法,利用SP Sepharose XL色谱柱纯化重组的免疫调节蛋白;将纯化后的蛋白作用于小鼠脾淋巴细胞和血细胞,用MTT法检测蛋白对脾细胞增殖和血细胞凝集的影响;用ELISA法检测蛋白对淋巴细胞分泌细胞因子的作用.结果经过SP Sepharose XL色谱柱纯化后可获得纯度为86%的重组蛋白;纯化蛋白浓度在80μg/m L时最大限度促进细胞增殖;蛋白浓度在2μg/m L时开始出现凝血;ELISA检测结果显示:重组的金针菇免疫调节蛋白能明显增强小鼠脾淋巴细胞分泌白细胞介素2(IL-2)的水平.结论经过SP Sepharose XL色谱柱纯化后可获得纯度较高的蛋白;纯化后的蛋白与小鼠脾淋巴细胞共同培养,不仅可以促进脾细胞的增殖,而且能增强小鼠脾淋巴细胞分泌白细胞介素2的水平;蛋白与血细胞共同培养能够促进血细胞的凝集.     

大鼠Neuritin基因启动子区克隆、鉴定及生物信息学分析

目的本研究旨在了解大鼠Neuritin基因启动子区特征,为明确神经受损后的再生中Neuritin基因在体内转录水平的调控提供理论依据。利用比较基因组学获取较为可靠的置信序列并设计上、下游引物克隆大鼠Neuritin基因5'调控区片段。方法采用生物信息学方法分析扩增片段序列特征,并采用多款转录因子预测软件预测大鼠Neuritin基因启动子主要调控区的转录因子结合位点。结果研究结果表明成功克隆出3447 bp大鼠Neuritin 5'调控区序列,大鼠Neuritin 5'调控区序列与小鼠同源率为91. 1%。生物信息学方法分析发现距大鼠Neuritin基因CDS区上游740～1012 bp位置处有一个Cp G岛,224 bp处有一个TATA-Box,初步推测大鼠Neuritin基因CDS区上游1100 bp为主要核心启动子区域。利用生物信息学软件预测主要调控区域含有AP-1,AP-2,AP-4和CREB等八个重要的转录因子结合位点。结论本研究大鼠Neuritin基因启动子的鉴定和相关转录因子结合位点的发现为进一步研究大鼠Neuritin基因的表达调控奠定了数据基础。     

烟曲霉Asp f3和Asp f4的表达纯化与多克隆抗体的制备

侵袭性曲霉病以烟曲霉在肺部定植、侵袭为主,具有较高的致死率.治疗侵袭性曲霉病的关键是早期确诊.目前临床上用于诊断侵袭性曲霉病的血清学方法是检测血清中半乳甘露聚糖循环抗原的GM试验,在敏感性和特异性方面存在局限性.为了用抗重组蛋白多克隆抗体鉴定和分析烟曲霉Asp f3和Asp f4特异性和曲霉广谱性表位,构建检测可疑血清样本中相应抗体的表位嵌合肽,以诊断侵袭性曲霉病.本研究表达纯化了烟曲霉Asp f3和Asp f4重组蛋白,制备了IgG抗体滴度均在1.28×106以上的高滴度的兔抗重组蛋白多克隆抗体.