诸葛菜(Orychophragmus violaceus)Toc33基因编码区的克隆及序列分析

以诸葛菜（Orychophragmus violaceus）新鲜嫩叶为材料提取总DNA，并以其为模板，根据已报道的拟南芥（Arabidopsis thaliana）Toc33基因的编码序列，设计一对PCR引物，扩增诸葛菜叶 本外膜蛋白转运器构件蛋白基因Toc33，得到两条扩增带，将这两条带分别割胶回收，与T载体连接转化E.coli，筛选重组子并测序，结果表明克隆到的这两个片段分别长1475bp，1573bp，通过同源性比较发现，它们之间的同源性达到88％，这两个片段与拟南芥Toc33基因有较高的同源性，分别命名为OvToc33-1,OvToc33-2。参考拟介Toc33外显子和氨基酸序列，分别确定了所克隆的两信诸葛菜Toc33基因片段的7个外显子和6个内含子，得到了诸葛菜Toc33基因的全编码区序列，并推导了其氨基酸序列，这两个DNA序列与拟南芥Toc33基因编码区的同源性分别高达91.8%和92.4%，说明这一蛋白是高度保守的。     

拟南芥中一个镍离子转运蛋白的亚细胞定位

离子的跨膜转运是细胞获取养分的重要环节,亦是植物在组织和器官水平上进行养分吸收运移的基础．在植物中镍（Ni）元素主要以Ni^2＋的形式存在,并通过Ni^2＋转运蛋白将其跨膜转运至相应的组织器官,参与氢酶和脲酶的合成．生物信息学分析表明,拟南芥中一个Ni^2＋转运蛋白AT2G16800含有叶绿体定位信息．克隆该基因5’端编码转运肽的272bp片段,与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合后,在拟南芥中高效表达,对其进行了亚细胞定位的研究．转基因植株通过共聚焦扫描显微镜的观察,发现GFP荧光信号只存在于叶绿体中,该结果表明A他G16800为叶绿体蛋白．     

大花蕙兰MADS-box基因ChMADS1的克隆及表达分析

根据MADS～box基因保守区结构,设计简并性引物,从大花蕙兰（Cymbidium hybridium）子房中分离和克隆到一个MADS—box基因全序列cDNA（ChMADS1）,序列分析表明该基因长871bp,含一个编码228个氨基酸的完整开放读码框,具有典型的植物MADS—box蛋白结构,由MADS盒、I、K、C区四部分组成．该基因编码的蛋白质与另两种兰花的AP3类MADS盒基因蛋白质PeAP3（89％／94%）和DcOAP3A（89％／95％）同源性较高,属于B组AP3基因家族中的paleoAP3基因．RT—PCR和反Northern杂交分析进一步证实其在子房以及花的各个器官中表达,是B组AP3基因家族中具特殊表达功能的一个新成员．     

编码普通野生稻磷酸盐转运蛋白基因片段的分离与克隆

以云南普通野生稻基因组DNA为模板，根据GeneBank中登记的编码小麦高亲和力磷酸转运蛋白基因保守序列设计一对特异引物，利用多聚酶链反应技术（PCR），扩增出目标基因（cwrpt)1002bp长度的基因片段并克隆到载体pGEM-T。经DIG标记探针杂交检测初筛，限制性内切酶酶切，PCR扩增，DNA序列分析与可能氨基酸序列同源性比较，此推定的氨基酸序列与小麦，水稻，拟南芥，番茄磷酸转运蛋白同源性很高，初步认为此基因片段为普通野生稻耐低磷胁迫相关磷酸盐转运蛋白的编码基因，获得全长序列与基因表达的进一步研究正在进行中。     

miRNA作用通路研究

后基因组时代的分子生物学研究需要从整体的角度,系统地阐述基因参与的生物调控过程,已有的通过构建基因调控网络的方式所做的系统生物学研究主要关注于蛋白编码基因之间的相互作用。随着近年来非编码RNA（noncoding RNA）,特别是miRNA研究的深入,显示生物体内存在着广泛的基因转录后调控。本论文通过建立综合蛋白质编码基因与miRNA基因相互作用关系的基因调控网络,分析了人类基因组中涉及miRNA的三类作用模式：（1）宿主基因与内含子miRNA共同作用于另一个蛋白编码基因。（2）miRNA簇中的不同miRNA分别作用于存在着相互作用的两个蛋白编码基因。（3）由两个宿主基因与其各自的内含子miRNA形成双向负调控回路。本研究的结果为进一步认识人类miRNA基因的功能特性提供了重要参考,研究所预测的数据为实验验证提供了依据。     

黑曲霉(Aspergillus niger)三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GPD)的序列测定与同源性分析

ｐＡＮＧＰＤ是用构巢曲霉ＧＰＤ基因片段为探针,从黑曲霉基因组文库中筛选到的一个三磷酸甘油醛脱氢酶基因（ＧＰＤ）阳性克隆．作者对该阳性克隆进行了亚克隆和序列测定,结果表明,基因片段总长２４４１个核苷酸（ｎ．ｔ）,其中５’－端非编码区长９８１ｎ．ｔ,编码区（从起始密码子ＡＴＧ到终止密码子ＴＡＧ）长１４４６ｎ．ｔ,３’－端非编码区长２４ｎ．ｔ,基因启动子区含有ｇｐｄ－盒和ＣＴ－盒序列,但无明显的ＣＡＡＴ盒和ＴＡＴＡ盒序列．ＧＰＤ基因由７个外显子和７个内含子构成,外显子全长１００８ｎ．ｔ,编码的蛋白质长３３６个氨基酸残基．通过序列比较分析,发现该基因与构巢曲霉的ＧＰＤ基因有许多相似之处;它们的基因启动子序列都含有ｇｐｄ－盒和ＣＴ－盒,其同源性分别为９６％和６５％;推测的两个ＧＰＤ蛋白的氨基酸同源性高达９０％;两个基因所含内含子数目及位置相同．     

人肥胖(obese)基因的人工合成及克隆

根据人肥胖基因的cDNA序列，通过合理的引物设计、链延伸反应、PCR反应以及分子克隆等步骤，成功地合成出编码瘦蛋白（Leptin）的肥胖基因（oB基因）全长片段，并将其克隆至PUc18载体质粒上．序列分析和酶切鉴定显示肥胖基因得到了正确合成和克隆．     

NACl启动子驱动GFP表达的组织特征及对生长素和赤霉素的反应

将拟南芥中转录因子基因NACl上游调控区1kb克隆到pRD420质粒，构建由NACl启动子驱动绿色荧光蛋白基因（GFP）表达的植物表达载体，并以此载体转化烟草，对阳性转基因植株研究表明，GFP在根部有较高水平的表达．进一步用生长素、生长素拮抗剂NPA和赤霉素处理，荧光强度的变化表明：该调控区受生长素作用的同时也受赤霉素诱导．初步说明NACl基因不仅是一个生长素反应基因，同时可能也是一个赤霉素反应基因．     

水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白基因的克隆、表达及检测

以水稻（粳稻）cDNA为模板,设计一对特异性引物,获得编码水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白基因的全序列,ORF区编码含535个氨基酸的蛋白,具有磷酸盐转运蛋白保守的蛋白激酶C作用位点、N端糖基化位点与酪蛋白激酶Ⅱ作用位点Southern blot分析显示此基因在水稻基因组中具有多个拷贝,与水稻基因组序列分析结果一致Westernblot预测目的基因表达的蛋白大小约为57．7ku．该基因的真核表达研究正在进行中．     

满江红鱼腥藻glnA基因上游调控区的克隆及其序列分析

以满江红鱼腥藻（Ａａｃ）提取总ＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ技术,扩增得到其谷氨酰胺合成酶基因（ｇｌｎＡ）上游区．经酶切得到４０９ｂｐ的片段,并将其连接到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡｋｓ＋上测序．将测序结果与Ａｎａｂａｅｎａ７１２０调控序列比较,有９８２％的同源性．在上游调控中也具有ｎｉｆｌｉｋｅ和Ｅ．ｃｏｌｉｌｉｋｅ启动子,值得注意的是,调节蛋白ＶＦ１的结合位点正好位于ｎｉｆｌｉｋｅ启动子上．所克隆的片段不但对蓝藻固氮、泌氨的基因调控研究具有意义,也对表达载体的构建具有实用价值．     

番茄红素β-环化酶基因（LcyB）启动子调控LcyB RNAi双元载体构建

根据番茄基因组DNA序列信息设计引物进行PCR扩增了Micro-Tom中番茄红素-环化酶（Lycopene -cyclase, LcyB）基因起始密码子上游1 534 bp启动子区域序列（LcyBp）,生物信息学分析表明,该启动子序列中存在TATA-盒、CAAT-盒、昼夜节律响应元件Circadian、光响应元件Box I、真菌激发子响应元件Box-W1、低温响应元件LTR、响应赤霉素的作用元件P-box、乙烯响应元件ERE、响应生长素的作用元件TGA-element等顺式作用元件. 依据番茄LcyB基因序列,设计2对含有不同酶切位点的特异引物进行PCR扩增LcyB基因3端特异的276 bp DNA片段,利用RNAi载体pKANNIBAL构建了LcyB启动子-LcyB基因正义片段（Sense）-PDK内含子-LcyB基因反义片段（Antisense）-OCS终止子的RNAi表达框,并将这一RNAi表达框插入植物双元表达载体pART27的Not I位点,构建成本研究的LcyB启动子驱动的LcyB基因RNAi植物双元表达载体pART-LcyBp-RNAi-LcyB. 为利用RNAi技术特异性敲除LcyB基因进而提高番茄果实中番茄红素含量奠定实验基础.     

人雄激素芳香化酶基因内含子中启动子的研究

利用核酸外切酶Ⅲ（ＥｘｏⅢ）对人雄激素芳香化酶基因的２４００ｂｐ片段的５’端进行系列缺失，并通过转染实验，分析了２４００ｂｐ片段３’端区域的功能作用，在雄激素芳香化酶基因第２外显子的下游区检测到１个具有启动子作用的功能元件，通过序列分析，发现该元件位于雄激素芳香化酶基因的第２内含子中。该启动子同样受到位于雄激素芳香化酶基因第１内含子中沉默因子的抑制作用。该启动子能够启动不同基因的表达，并且具有较强     

Kas基因启动子区的克隆及功能初步分析

利用TAIL-PCR技术,克隆到了与辣椒素合成有关的胎座特异表达基因——3-酮酯酰．ACP合成酶基因（Kas）上游400bp的调控区域．将其全长片段与GUS基因连接构建植物表达载体并转化烟草．GUS组织化学染色表明,克隆到的440bp片段具有启动子活性．对该片段进行序列分析发现,在起始密码子ATG上游存在2个TATA-box,分别为-316～-311位的TATAAA和-224～-219位的TATAAA;在TATA-box上游还存在1个位于-378～-374处的CAAT-box,序列为CCAAT．该研究旨在为利用基因调控辣椒素的生物合成,提高辣椒果实中的辣椒素含量奠定基础．     

薄壳山核桃嫁接愈合过程中CiMYB46基因的克隆与表达分析

【目的】为探索薄壳山核桃嫁接愈合的分子机理,对CiMYB46基因进行克隆,并分析其表达模式及启动子区的诱导元件。【方法】提取薄壳山核桃芽接愈合部位不同发育时期的RNA,根据转录组学分析结果设置引物,通过RT-PCR进行基因克隆。以基因组DNA为模板,使用PCR方法克隆目标基因的启动子区域。【结果】克隆得到1条序列,该序列的开放阅读框(ORF)从起始密码子ATG开始,到终止密码子TAA结束共969 bp,编码322个氨基酸,所推导的氨基酸含有MYB结构域,与拟南芥中的AtMYB46聚为一类,将其命名为CiMYB46。实时定量PCR分析显示,CiMYB46在嫁接体发育的维管组织形成期具有高表达,并与部分次生壁合成相关功能基因具有共表达趋势。克隆得到CiMYB46起始密码子上游1 070 bp的启动子区域,经PlantCARE分析,结果显示CiMYB46启动子区域具有CAAT-box及TATA-box的基本顺式作用元件和多个胁迫诱导元件,同时还具有响应包括脱落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、水杨酸在内的激素调控元件。【结论】CiMYB46可能与薄壳山核桃嫁接愈合过程中维管组织的形成有关,并受赤霉素诱导。     

大豆11S球蛋白基因Gy1启动子克隆及序列分析

以高蛋白大豆品种南农87C-38总DNA为模板,采用PCR法扩增获得约1100bp大小的DNA片段,回收该片段并克隆到puCm-T载体上,选取阳性克隆进行PCR和酶切检测,再进行测序分析.序列分析显示该片段含1174个核苷酸,采用Vector NTI软件将试验中克隆的序列与GenBank E07850报道的Gy1启动子和GenBank X15121报道的Gy1启动子及信号肽对应序列分别进行比对,同源性分别为99.6%和99.3%.确定该片断为南农87C-38大豆11S球蛋白基因Gy1启动子及信号肽.该启动子的成功克隆,可为今后利用基因工程技术改良大豆种子营养品质研究奠定基础.     

中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子克隆与分析

为了探明中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子表达调控机制,利用DNA步移法克隆了中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子及其上游调控序列,总长1 100bp.分析表明,在基因转录起始位点上游-30～-24bp处有1个TATA box,未发现有CAAT box和GC box.同时,在上游调控区还存在有多个可能影响启动子转录活性的顺式作用元件,如NF-κB,YY1和SP1等转录因子结合位点.这些结果为深入研究中国明对虾卵黄蛋白积累及卵子发生过程奠定了基础.     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

GCC box in<Emphasis Type="Italic">Arabidopsis PDF1.2</Emphasis> promoter is an essential and sufficient cis-acting element in response to MeJA treatment

The expression of Arabidopsis PDF1.2 gene isregulated by jasmonic acid (JA) and ethylene (ET). It also has been well documented that GCC box is an element responsive to ET, however, the responsive mechanism of JA in such plant defense gene expression is unclear. In this paper, the authors define the essential cis-acting element in PDF1.2 promoter responsive to methyl jasmonate (MeJA) through fragment deletions and site-directed mutageneses combiningAgrobacterium-mediated transient reporter gene expression in tobacco leaves. Firstly, the MeJA inducible expression o fPDF1.2 was confirmed by using the upstream -1.86 kb fragment of PDFI.2 gene. Secondly, the upstream -300— -243 bp fragment of the promoter was evidenced to respond to MeJA. To further characterize this promoter region, three point mutations were introduced into the -300— -243 bp fragment of the promoter. This result showed that the mutation of GCC box abolished MeJA induction, whereas the mutations of the G box-like and the imperfect palindrome sequence did not significantly decrease MeJA inducible effect, indicating that GCC box in PDFI.2 is essential for MeJA induction. The sufficient responsiveness to MeJA of this GCC box was further investigated by 4xGCC fused upstream to the CaMV 35S minimal promoter. This result suggested that the fused promoter was able to activate reporter gene expression in response to MeJA. Thus these results indicate that the GCC box in PDFI.2 is an essential and sufficient element to confer MeJA induction.     

杨树木质部特异性定位表达4CL1启动子的结构与表达特性

4-香豆素COA连接酶(4CL1)是木质素代谢途径中的一个关键酶,对该基因启动子的表达特性与调控元件进行了研究:首先,对毛白杨4CL1启动子进行了生物信息学分析,结果表明该启动子包括3个顺式作用元件,box P(CCTTCACCAACCCCC),box A(CCGTTC),box L(TCTCACCAACC),这3个顺式作用元件在已知的木质素代谢途径相关酶系如苯丙氨合成酶(PAI)和4CL中普遍存在;其次,运用PCR方法对该启动子进行了剪切,获得一个长393 bp的启动子片断,该启动子片断包括以上3个顺式作用元件;最后,将该启动子片段与GUS报告基因构建了植物表达载体并转化烟草,成功获得转基因再生苗,结果发现转基因烟草的茎木质部呈现GUS染色阳性.研究结果表明,一个393 bp长度的4CL1启动子片断足以介导外源基因在木质部特异性定位表达.