胡萝卜lea基因cDNA片段的克隆及其表达特性分析

在ＭＳ培养基中加入高浓度的蔗糖,可使胡萝卜体细胞胚的发育静止于子叶胚阶段,而当蔗糖浓度恢复到正常水平时,静止的体细胞胚便转入胚后发育。采用ＲＴ－ＰＣＲ的方法,从调控状态的胡萝卜体细胞胚中获得ｌｅａ基因Ｄｃ３家族一个新成员的ｃＤＮＡ片段。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果表明,该基因在调控状态的胡萝卜体细胞胚中具有强表达活性;在解调控１２ｈ的胡萝卜体细胞胚中,表达活性明显降低;解调控２４ｈ之后,其表达活性则基     

猪leptin受体基因OBR的表达检测与部分片段克隆分析

采用ＲＴ－ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交的方法分析了猪ｌｅｐｔｉｎ受体ＯＢＲ基因在１１种组织和器官（心肌、肺、肝、脾、肾、肌肉、卵巢、脂肪、大脑、垂体、下丘脑）中的表达分布,结果表明ＯＢＲ基因在１１种组织和器官中都有表达,其中在肺、肝和下丘脑的表达高于其他组织。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析结果显示,编码长细胞内区的长片段表达形式只在下丘脑组织中表达,而已有证据表明只有编码长细胞内区的长片段表达形式才具有     

萤火虫荧光素酶基因在家蚕中的表达

萤火虫荧光素酶Luciferase(EC1.13.12.7)在MgATP存在时,催化D-荧光素氧化脱羧,同时发出可见光,最大发射波长为562nm.总反应式如下:Luciferin ATP O_2(?)Oxyluciferin AMP PP_i H_2O hv医学中用荧光素酶测定ATP的含量,不仅简便、准确、而且灵敏,可以检测到10~(-14)mol/L水平的ATP.近年来分子生物学中应用荧光素酶基因作报道基因.应用现代检测仪器可以检测到10~(-19)mol的酶量,比检测CAT灵敏100—1000倍.现在发展了将底物D-荧光素渗透到细     

中间脉孢霉谷氨酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌和烟草中的表达

用谷氨酸脱氢酶（GDH）提高植物氮肥利用率是国际上生物工程研究的热点之一,通过RT－PCR方法克隆了真菌中间脉孢霉（Neurospora intermedia,简称Ni),好食脉孢霉（N.sitophila),粗糙脉孢霉（N.crassa)的gdh基因,进行序列测定,前两种gdh基因的序列为首次报道。分别将上述gdh基因克隆入pET30a质粒在大肠杆菌中表达,纯化后进行酶活性及米氏常数（Km)测定,结果发现大肠杆菌表达的Ni-GDH具有更高的酶活性,其Km值在0．3－0．45mmol/L左右。选择Ni-GDH基因转化烟草,发现它能促进烟草在低氮水平下的生长。     

促甲状腺激素释放激素受体基因在小鼠睾丸中的表达

促甲状腺激素释放激素(Thyrotropin-releasing hormone,TRH)为Shally等人于1969年从羊和猪的下丘脑中提取并分离纯化的3肽。TRH与垂体前叶促甲状腺激素细胞特异性受体结合刺激促甲状腺激素(TSH)的合成和分泌。应用免疫组织化学,TRH定位于睾丸内间质细胞中,且TRH基因也已在人、大鼠和小鼠的睾丸中表达。然而,TRH是否通过特异性受体作用于睾丸仍不清楚。目前,编码TRH受体(TRH Receptor,TRH-R)的cDNA克隆已从小鼠垂体促甲状腺激素肿瘤细胞中分离出来,其氨基酸序列显示TRH-R是由7个跨膜区的单一肽链构成,属G蛋白偶联型受体超家族。大鼠和小鼠的TRH-R的核苷酸和氨基酸序列具有高度同源性。TRH可能通过G蛋白偶联受体起到内分泌和神经药理作用。Satoh等人通过Northern印迹杂交和反转录-PCR发现小鼠、大鼠和人的睾丸组织中特异性表达了TRH-R基因,但无定位结果。本文应用原位杂交组织化学(ISHH)技术,首次观察了TRH-R mRNA在小鼠睾丸中的表达和定位,现报道如下:     

乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因在海带中的表达

用自建的海带模式转化体系,以基因枪转化法获得转乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因海带.转基因海带HBsAg蛋白的平均表达量为0.529μg·（mg可溶性总蛋白）-1,最高可达2.497μg·（mg可溶性总蛋白）-1,且表达产物具有天然表位（epitope）.经PCR-Southern,总DNA的Southern blot及ELISA定量检测证明,外源基因已发生整合并已正常表达.通过表达水平的横向比较,提示转基因海带生产乙肝疫苗具有开发潜力,海带作为大型海藻表达系统,有望在高附加值产品生产与海洋环境保护方面发挥独特作用.     

多个抗病抗虫基因在水稻中的遗传和表达

将２￣３个抗真菌病基因与潮霉素磷酸转移酶基因串联在一载体上,两个抗虫基因与ＰＰＴ乙酰转移酶基因串联在另一载体上,利用基因枪法将它们按照１：１的摩尔比共同导入到水稻胚性愈伤组织中。通过潮霉素抗性筛选共得到５５个独立的再生植株系,其中,有７０％的转基因植株含有６￣７个外源基因,且位于同一载体上的几个外源基因总是共同导入到水稻植株中,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析证明多个外源基因均能稳定表达。在分析的含     

TNV-A~C亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate,TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录.在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明,TNV-AC亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G2184,亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G2460.进一步分析表明,亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失,但不影响病毒在烟草原生质体中的复制,说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动,是病毒造成枯斑所必需的基因.通过原核表达产物分析,证明了亚基因组RNA2中外壳蛋白(coat protein,CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG.CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明,完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的,但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响.综合以上结果,对TNV-AC的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

MBLL cDNA的克隆及组织表达分析

果蝇的ｍｂｌ基因编码一个核蛋白,含有２个Ｃｙｓ３Ｈｉｓ锌指基序。ｍｂｌ基因的突变将影响果蝇所有光感受器细胞的分化。根据与ｍｂｌ基因高度同源的人ＥＳＴ ＡＡ０８６１３９设计ＰＣＲ引物,筛选胎儿脑ｃＤＮＡ点阵文库,得到一个人ｃＤＮＡ,命名为ＭＢＬＬ。     

TNV-AC亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate, TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录. 在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明, TNV-A^C亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G²¹⁸⁴, 亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G²⁴⁶⁰. 进一步分析表明, 亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失, 但不影响病毒在烟草原生质体中的复制, 说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动, 是病毒造成枯斑所必需的基因. 通过原核表达产物分析, 证明了亚基因组RNA2 中外壳蛋白(coat protein, CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG. CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明, 完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的, 但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响. 综合以上结果, 对 TNV-A^C的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

内皮素A型受体(ET_A-R)基因在大鼠心血管系统细胞中的表达

内皮素A型受体cDNA由Lin首先从大鼠肝脏cDNA文库中克隆出来.它为在分子生物学水平研究ET受体提供了一个可靠的基础.现已证明,ET受体主要分为两种亚型(A型和B型).A型受体主要分布在平滑肌细胞,B型受体则主要存在于内皮细胞.这两种亚型受体是由不同基因编码,ET和ET_A受体结合后,可使血管收缩,引起平滑肌细胞的增殖,可能与高血压的发病有密切关系.而当ET和ET_B受体结合后,则会引起EDRF等舒血管物质的释放.     

反转录病毒介导的人凝血因子IX小基因在奶山羊乳腺中的分泌表达

通过受精卵显微注射胚胎移植建立哺乳动物乳腺生产系统是近年来生物工程领域的研究热点,但该工作周期长、成本高、难度和工作量都很大.1994年Johanna等人曾经报道以反转录病毒作载体将hGH(human growth hormone)cDNA导入山羊乳腺组织并获得表达.但是由于病毒LTR控制下的hGH基因的表达在活体动物乳腺组织内受到一定程度的抑制,因此表达水平比较低,持续时间短.我们以微小MCK(Muscle creatine kinase)增强子,β-actin启动子控制hFⅨ(human clotting factorⅨ)小基因(minigene)表达顺序反向插入GINa框架,构建为复制缺陷反转录病毒载体.首次通过反转录病毒直接转染活体奶山羊乳腺小叶和乳腺导管导入的方法建立了hFⅨ蛋白的乳腺表达系统.hFⅨ蛋白在羊奶中的最高表达量为47.9ng/mL乳汁,其中1头奶山羊2个月后表达量仍维持在12ng/mL乳汁.Western blot和活性检     

胡萝卜lea基因cDNA片段的克隆及其表达特性分析

在MS培养基中加入高浓度的蔗糖 ,可使胡萝卜体细胞胚的发育静止于子叶胚阶段 ,而当蔗糖浓度恢复到正常水平时 ,静止的体细胞胚便转入胚后发育 .采用RT_PCR的方法 ,从调控状态的胡萝卜体细胞胚中获得lea基因Dc3家族一个新成员的cDNA片段 .Northern杂交结果表明 ,该基因在调控状态的胡萝卜体细胞胚中具有强表达活性 ;在解调控 1 2h的胡萝卜体细胞胚中 ,表达活性明显降低 ;解调控 2 4h之后 ,其表达活性则基本消失 .由此及相关结果推测 ,通过改变培养基中的蔗糖浓度 ,可以使悬浮培养的胡萝卜体细胞胚胎重现类似于天然种子休眠与萌发的发育过程 .     

基质金属蛋白酶基因MMP20在人食管癌发生发展中的表达差异分析

研究了基质金属蛋白酶基因MMP20在人食管癌发生发展过程中的表达变化。用RT－PCR检测配对食管癌手术标本及食管癌早期活检组织中MMP20基因表达,用免疫组织化学染色和Western印迹检测表达的MMP20蛋白。发现MMP20基因在mRNA和蛋白质水平上均为食管部过表达,MMP20基因的表达在食管癌发生早期未见明显升高,在浸润癌期明显过高表达,提示在食管癌发展中MMP20过表达与癌细胞浸润相关,是食管癌演进过程中的晚期事件。     

棉花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆和表达特性分析

根据不同植物编码半胱氨酸蛋白酶基因的保守序列, 设计兼并引物, 通过PCR 和RACE技术, 从辽棉9号衰老叶片中克隆了编码半胱氨酸蛋白酶的cDNA, 其相应的基因命名为Ghcysp, 该基因序列的长度为1368 bp, 包含一个1034 bp的可读框, 编码344个氨基酸, 分子量为37.88 kD, 等电点为4.80. 数据分析结果显示, 该蛋白质由1个19个氨基酸残基组成的信号肽和3个酶活性催化反应中心组成, 是一个跨膜蛋白质, 位于液胞膜上. Ghcysp蛋白质与其他植物半胱氨酸蛋白酶的氨基酸同源性为67%~82%. Northern杂交结果表明, 在棉花衰老的根、脱落的花、下胚轴、胚珠和幼叶中, Ghcysp基因不表达, 在棉花的衰老叶片中Ghcysp基因表达量高.     

兔防御素NP-1基因在转基因烟草中的表达及其对烟草青枯病的抗性研究

从兔子肝脏细胞中扩增到防御素NP_1成熟肽的编码序列 ,长约 2 0 0bp .将此片段插入到切除了GUS编码序列的pBI1 2 1质粒载体中 ,构建成植物表达载体 pBIC_35SNP1 .通过根癌农杆菌介导的叶盘法 ,将pBIC_35SNP1导入烟草细胞中 ,并获得了经Southern杂交证实的转基因植株 .进一步的Northern杂交证明防御素NP_1基因能够在转基因植株中正常转录 .抗菌实验表明转基因植株增强了对烟草青枯病的抗性并延缓了烟草青枯病的发病     

生物医用纳米材料在增强肿瘤细胞免疫原性死亡中的应用

激活机体的适应性免疫反应是提升长期抗肿瘤疗效的关键因素.化学治疗、放射治疗、光动力治疗(photodynamic therapy, PDT)等方法可诱导肿瘤细胞发生凋亡并伴随着免疫原性死亡(immunogenic cell death, ICD). ICD引起的损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)分子的暴露或释放可刺激免疫系统发挥抗肿瘤免疫作用,招募抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC),激活T细胞适应性免疫应答.因此,在肿瘤免疫治疗中ICD诱导剂可以改善其治疗效果,从而提高患者生存率.越来越多的研究表明,基于纳米材料的癌症治疗平台不仅可以实现特定肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)刺激响应的药物控制释放,并且其可以调节TME进而诱导肿瘤细胞发生ICD,这撞击出了癌症纳米医学的新火花.自此以后,设计和构建增强肿瘤ICD效应的生物医用材料的相关研究受到了极大关注.基于此背景,本文首先介绍了肿瘤ICD的成因以及纳米材料在诱导肿瘤ICD中发挥的多重功能.其次...     

拟南芥动蛋白基因AtKP1的克隆、表达及生物化学特性分析

动蛋白(kinesin)种类很多, 在真核细胞中行使多种功能. 利用3′-RACE 技术从拟南芥中克隆了动蛋白-14B 亚家族中的一个成员, 命名为AtKP1 (拟南芥动蛋白1). 其最大可读框为3.3 kb, 编码1087个氨基酸. 结构域分析表明,AtKP1多肽链中部有一个马达结构域, 氨基端有一个CH结构域, 羧基端一个含有202个氨基酸残基的序列表现出很强的特异性. Northern印迹表明, AtKP1基因在各种器官中广泛表达, 但在幼苗中表达量最大. 将克隆的长度为2808 bp的AtKP1启动子区域与GUS 基因进行了融合, 转基因分析显示, AtKP1主要在幼嫩器官维管束和幼叶表皮毛中表达, 表明AtKP1可能参与了维管束和叶表皮毛的分化或发育. 对AtKP1的马达结构域进行了原核表达和亲和纯化, 生物化学特性研究表明这个马达结构域可以核苷酸依赖的方式与微管结合, 且具有微管激活的ATP酶活性.     

小鼠金属硫蛋白突变体ββ基因在生菜中的表达及高锌生菜的培育

将人工合成的金属硫蛋白结构域突变体ββ基因克隆到植物高效表达载体pGPTVd35S中,用根瘤农杆菌介导的叶盘法转化生菜品种Salinas88,得到了抗除草剂的转化植株,PCR和Southern印迹分析表明,ββ基因已经整合到生菜基因组中,Northern和Western印迹分析表明,ββ基因可以在生菜中正常转录和表达,并能通过有性繁殖传递给后代,不同生长条件下的转基因生菜中,锌的含量都明显高于对照植株。