巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris,P .pastoris)是一种广泛使用的外源基因表达系统 ,该系统不仅具有高效表达、高稳定、高分泌、高密度生长等特点 ,而且可以对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工等显著优点。该研究对巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及研究进展作了简要的综述     

重组毕赤酵母表达猪胰岛素前体代谢参数分析和动力学模型

采用发酵过程参数相关分析理论,分析了毕赤酵母在不同发酵阶段利用不同碳源时的生理代谢参数变化特征。同时,研究了不同比生长速率下重组毕赤酵母表达猪胰岛素前体补料分批发酵过程,建立蛋白表达阶段的细胞生长非结构模型,结果表明:比生长速率和甲醇浓度符合Monod方程,最大比生长速率(μmax)为0.101h-1,基质的半饱和常数(Ks)为0.252g/L,细胞得率系数YX/S=0.386g/g,细胞维持系数m=0.011g/(g·h)。当比生长速率为0.016h-1时猪胰岛素前体(PIP)最大比形成速率(qp,max)达0.098mg/(g·h)。该模型能较好预测毕赤酵母表达阶段细胞生长和PIP表达的发酵趋势,用其控制发酵过程,目标蛋白PIP产量为优化前的1.5倍,达0.976g/L。     

牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的表达

构建3株表达凝乳酶的重组毕赤酵母,通过甲醇诱导收集BMMY液体培养基上清后,通过Arima K方法分别对其进行酶活测试并进行酶学性质分析.结果表明,GS115/pPIC9K-chy1菌株诱导7d后,其酶活达到1.905SU/mL重组凝乳酶的最适反应温度为45℃;最适反应pH为6;在pH 4~7之间凝乳活性相对稳定;在50℃以下可以保持酶活,在55℃处理50min后,丧失60%的活性.     

产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建

根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子,采用基因半合成技术合成人胰岛素基因.将合成的胰岛素基因克隆到pP IK 9质粒,构建了毕赤(P ich ia)酵母重组表达载体pP IN S319,用B g lⅡ线性化后用电转化法导入毕赤酵母G S ll5菌株,经过营养筛选和PCR复筛,得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株.经SDS-PAGR和密度扫描分析表明,合成的人胰岛素基因能够在毕赤酵母中高效分泌性表达,表达量可达0.563 m g/mL,表达产物无需转肽过程,只经过胰蛋白酶和羧肽酶B简单处理即得到优质重组人胰岛素,其体内活力约为30 IU/m g.     

人胰岛素原密码子的优化及其在毕赤酵母中的表达

依据毕赤酵母偏好密码子,设计合成长效人胰岛素原( human proinsulin,HPI)基因序列,所合成的HPI基因全长为200 bp,并在其N端添加信号肽(EEAEAEAEPK)以提高目的蛋白表达.将改造后基因克隆到pPIC9K载体中,构建分泌表达型载体pPIC9K-HPI,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中.用遗传霉素G418梯度筛选获得高拷贝菌株,在甲醇诱导下表达分子质量为7.87 ku的HPI,利用金属螯合层析纯化蛋白质,胰蛋白酶酶切后利用人胰岛素试剂盒测得生物活性,HPI摇瓶最高产量可达35.4mg/L.该研究为获得大量长效胰岛素基因工程产品奠定研究基础.     

血小板生成素在毕赤酵母中的表达

以人胎肝cDNA文库为模板,用PCR和DNA重组技术,将TPOcDNA克隆到pGEM     

巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达rHCMVp的研究

目的：提高人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)在巴斯德毕赤酵母中的表达量,并进行发酵罐高密度发酵。方法：将生长培养基的菌体离心后等量接入诱导培养基中(包括不同体积分数的甲醇、pH值)培养,通过菌体密度检测和发酵液上清的SDS—PAGE结果分析不同条件、不同诱导时间对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响,并依据优化条件进行高密度发酵。结果：摇瓶培养时,转化子在体积分数1％的甲醇pH6．0的条件下诱导72h,A600(菌体密度)为45．2,目的蛋白表达量达到10．2mg／L。2L发酵罐进行了高密度发酵,经体积分数1％甲醇诱导48h,最终A600(菌体密度)达到124,每升发酵液中含目的蛋白57．21mg。结论：通过条件优化,进行高密度发酵,获得大量的rHCMVp。     

纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

构建pPICZαA-NK重组质粒，并转化入E.coli TOP-10中，得到转纳豆激酶基因工程菌，提取重组质粒经单酶切，双酶切，PCR分析及序列测定，证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因，将重组质粒pPICZαA-NK线性化后，分别转化毕赤酵母GS115与KM71，在含Zeocin^TM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母，经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性，SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%左右。     

SOD-肝素结合结构域融合蛋白的毕赤酵母重组菌株构建及表达

利用基因工程技术将人源Cu, Zn-SOD与EC-SOD的C末端肝素结合结构域（HBD）的编码序列进行密码子优化并人工合成,然后电转化至毕赤酵母进行表达.单因素实验表明,与现有研究的一些重组EC-SOD相比,其比活力提高了1.30～3.78倍.正交分析得最佳摇瓶条件为诱导时间为5 d,初始pH值为5.2,诱导剂量的体积分数为1.0%,酶活可达1 120.2 U?mL^-1,是初始酶活的2.94倍;这些结果表明,SOD-HBD融合蛋白在一定程度上解决了重组EC-SOD表达量低的问题,为重组EC-SOD蛋白的推广与应用提供重要的物质基础条件.     

培养条件对重组毕赤酵母高密度表达猪胰岛素前体的影响

研究了基因工程菌P ich ia p astotis高密度、高表达的培养条件。在全合成摇瓶培养基的基础上,考察了诱导过程中甲醇浓度、温度、pH、(NH4)2SO4及磷酸盐浓度等因素对猪胰岛素前体(P IP)表达的影响。研究表明:甲醇的最佳诱导浓度为6 g/L,过高或过低的甲醇浓度都不利于菌体生长和蛋白表达;在菌体生长和蛋白表达阶段,pH应分别控制在5.5和4.0;诱导阶段,培养温度下降到28°C,可以提高重组蛋白质的表达量。上述结果用于15 L全自动发酵罐实验,P IP表达水平达到了1.69 g/L,是摇瓶结果的17倍。     

毕赤酵母密码子用法对人骨形成蛋白6表达的影响分析

对已筛选出的毕赤酵母阳性转化子菌株（His＋Mut＋）和（His＋Muts）进行PCR验证,用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组骨形成蛋白6的表达情况,为了解释无表达的结果,对酵母的密码子与重组骨形成蛋白6的密码子兼容性进行了理论上的初步分析。     

重组人胰岛素及C肽的分离纯化

对基因工程构建的含重组人胰岛素和C肽基因的毕赤酵母工程菌进行诱导表达，工程菌用甲醇诱导72 h后，离心去除菌体，上清液经中空纤维膜超滤后SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析，0~400 mmol/L NaCl梯度洗脱，得到纯度大于92％的重组人胰岛素原。经Lys-C酶和羧肽酶B酶切后，Sephadex G-25柱分离，得到了重组人胰岛素和C肽。     

胞内表达猪生长激素基因的重组酵母菌构建与鉴定

将猪生长激素(pGH)cDNA定向插入毕赤酵母胞内表达载体pPIC 3.5k质粒,重组构建了pPIC 3.5kpGH/GS115酵母表达系统, 其表达产物的SDSPAGE和Western blot结果表明, pGH蛋白在胞内获得正确表达,表达量达378 mg/L.     

类人胶原蛋白基因工程菌诱导后比生长速率优化

目的优化类人胶原蛋白基因工程菌高温诱导后的比生长速率。方法通过分析不同比生长速率下发酵液中菌体浓度、类人胶原蛋白浓度、细胞得率系数(YX/S)、产物得率系数(YP/S)的变化,确定诱导后的最佳比生长速率。结果当比生长速率为0.04～0.05h-1,细胞浓度和类人胶原蛋白的浓度分别可达69.5g/L(DCW)和13.8g/L。结论诱导后的比生长速率对细胞生长、类人胶原蛋白的合成均产生显著性影响。     

Therapeutic induction of angiogenesis by direct myocardial administration of an adenovirus vector encoding human hepatocyte growth factor gene and its safety

After the study in vitro and in rats, we assessed further the effects and safety of local angiogen therapy using intramyocardial delivery of an adenovirus carrying hepatocyte growth factor gene (Ad-HGF) in a canine ischemia model. The angiogenic activity of Ad-HGF was evaluated from three aspects. First, the augmentation of collateral vessel development was assessed by angiography 30 d after surgery. The results showed that the density of collateral vessels in treated group was higher than that of control group. Secondly, infarct size was evaluated by TTC staining and image analysis. The results showed that the infarct size of treated group was smaller than that of control group. Thirdly, the myocardial regional blood flow was determined by the method of colored microspheres. The results showed that the blood flow recovered to the level before ligation in treated group, but that of the control group was lower than normal level. In addition, during the study of chronic toxicity, we tested the anti-adenovirus antibodies by neutralization method. The antibodies yielded after the fourth injection decreased slowly from peak level and disappeared 12 weeks after drug withdrawal. Overall, Ad-HGF can promote angiogenesis in ischemic myocardium and reduce infarct size. So this method may be considered as a therapeutic angiogenesis induction strategy for ischemic disease including myocardial infarction and peripheral artery disease. At the same time, Ad-HGF could induce the yield of anti-adenovirus antibodies to neutralize adenovirus, which may be the mechanism of adenovirus clearance.     

鸽毛滴虫病原学,致病性和体外培养

首次报道我国鸽毛滴虫 Trichomonas columbae 的病原学、致病性和体外培养,共调查家鸽 470只,阳性270只,阳性率达58％。30只死亡的病鸽剖检示明上消化道有炎症、干酪样坏死和结节等病变。肝脏亦出现干酪状坏死块。少数病鸽的肺脏呈严重淤血。体外培养表明该虫在肝浸汤培养基生长最佳,其次为蛋黄浸液培养基。林格氏生理盐水培养生长最差。     

质谱和动力学技术研究胰岛素-多糖纳米粒稳定性和释放胰岛素速率

以海藻酸钠(sodium alginate,SA)和壳聚糖(chitosan,CS)为纳米粒包被材料,构建胰岛素(insulin,INS)多糖纳米粒.采用基质辅助激光解吸电离飞行时间(Matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight,MALDI-TOF)质谱技术研究若干化学因素影响INS-多糖纳米粒的稳定性.选用电子光谱技术研究INS-多糖纳米粒控释INS速率及动力学特性.实验结果表明,INS-SA纳米粒在Tris-HCl缓冲液(pH7.2)和醋酸介质中均呈不稳定状态,易释放INS;而INS-CS纳米粒在Tris-HCl缓冲液中呈较为稳定状态,其释放INS速率明显慢于INS-SA纳米粒,并遵循一级反应动力学过程.INS-SA和INS-CS纳米粒均能有控制INS释放速率能力,但两者释放速率明显不同,其速率可分为快速与慢速释放方式.CS比SA更适合于作为包被材料研制INS-多糖纳米粒口服制剂.     

Mg对Zn--11%Al合金镀层凝固组织及合金层生长的影响

将工业纯铁分别在510℃的Zn-11%Al、Zn-11%Al-1.5%Mg、Zn-11%Al-3%Mg和Zn-11%Al-4.5%Mg合金熔池中进行不同时间的热浸镀,使用X射线衍射仪、扫描电子显微镜、能谱仪等仪器设备,研究Mg含量对Zn-11%Al合金镀层凝固组织和镀层中Fe-Al合金层生长的影响.结果表明：Zn-11%Al合金镀层凝固组织由富Al相和Zn/Al二元共晶组成;随着Zn-11%Al-x%Mg合金中Mg含量的增加,合金镀层的凝固组织中逐渐出现Zn/Al/MgZn2三元共晶、块状 MgZn2相和Al/MgZn2二元共晶.四种合金镀层中合金层主要由Fe2 Al5 Znx和FeAl3 Znx相组成,合金层的厚度随浸镀时间的增加而增加,Mg含量的增加使Fe-Al合金层生长速率指数和生长速率降低.在Zn-11%Al合金镀层中Fe-Al合金层形成的初期,可形成致密稳定的Fe-Al化合物层;热浸镀120 s后,扩散通道的移动使Fe-Al化合物层失稳破裂. Zn-11%Al-x%Mg合金中Mg元素可明显推迟液Zn进入镀层中Fe-Al合金层的时间,使Fe-Al合金层更加稳定和致密.     

重组人生长激素对脓毒症引起的急性肺损伤/呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)患者的营养状况和免疫功能的影响

探讨重组人生长激素(rhGH)对脓毒症引起的急性肺损伤/呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)患者的营养状况、蛋白质代谢、免疫功能等方面的作用和影响,66例脓毒症引起的急性肺损伤/呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)患者随机分成两组,对照组33例,给予标准的营养支持治疗;治疗组(rhGH)33例,在对照组标准营养治疗基础上,加用rhGH。所有患者均于入院时和治疗后第14 d,测量肱三头肌皮褶(TSF)厚度、外周血血清白蛋白(ALB)、转铁蛋白(TRF)、前清蛋白(PA)、肌酐、尿素、TNF-α、IL-1、免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)变化。治疗组与对照组相比:1营养状况指标TSF厚度、ALB、TRF、PA均明显增加(P0.05),肌酐、尿素均明显减少(P0.05);2炎症反应指标TNF-α、IL-6均明显减少(P0.05);3免疫功能指标(免疫球蛋白IgA、IgM、IgG)均明显增加(P0.05)。说明rhGH在脓毒症引起的急性肺损伤/呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)患者的营养状况、免疫功能和蛋白质代谢水平方面具有较好的作用。