应用DOP—PCR与染色体涂染技术鉴别赤麂的Y染色体

流式细胞仪分离小麂的Y染色体,并应用DOP－PCR扩增后标记作为探针,分别与雄性及雄性赤麂中期核型进行了染色体涂染,结果表明,只有雄性赤麂Y2染色体与探针有明显的杂交信号,说明只有Y2染色体与赤麂的性别决定相关,除除了相麂Y1染色体在性别决定中的作用。     

葎草单染色体的显微分离及DOP-PCR技术体系建立

葎草是具有XX/XY1Y2性染色体系统的雌雄异株植物,是研究植物性染色体演化的模式材料之一.利用染色体显微分离技术从葎草根尖有丝分裂中期分裂相中将单条染色体进行了显微分离及DOP-PCR(Degenerate oligonucleotide primer-PCR)扩增,并构建了单染色体DOP-PCR扩增产物的荧光探针,对葎草根尖有丝分裂中期分裂相染色体进行了荧光原位杂交,其结果表明荧光信号分布在所有的染色体上,表明所建立的技术体系能够成功分离葎草单染色体并进行DNA扩增.本研究结果为进一步进行葎草X,Y染色体的细胞及分子生物学研究提供了技术支持.     

2种PCR技术扩增微分离的蚕豆染色体

用接头介导的PCR (polymerase chain reaction, LA-PCR) 和简并寡核苷酸PCR(DOP-PCR)2种技术对微分离的蚕豆(vicia faba)大M染色体进行了扩增,并对扩增结果及2种PCR技术的优缺点进行了比较.结果表明,LA-PCR的扩增产物大小为0.3～3kb, 而DOP-PCR的扩增产物大小为0.3～1.3kb. LA-PCR的对照中未观察到扩增产物,而DOP-PCR的对照中却明显观察到扩增产物,此扩增产物是由于引物之间相互退火而形成的二聚体或更高级的聚合体. LA-PCR的Southern杂交信号明显强于DOP-PCR,可见LA-PCR的扩增效率明显高于DOP-PCR.     

LA-PCR法制备赤麂Y2涂染探针与原位杂交

应用显微切割技术获得赤麂的Y2单条染色体,经LA-PCR（linker-adaptor PCR）扩增后用DIG标记制备探针,然后用Southern blot杂交法对所制备的探针进行验证并对毛冠鹿的中期核型进行原位杂交.结果表明：用该法制备的涂染探针是成功的,原位杂交也获得了阳性结果,可以初步验证毛冠鹿中的Y染色体.     

赤麂Y2染色体的多态性及其与赤麂性别决定机制的关系

发现赤麂Y2染色体的长臂在形态和结构上存在多态 ,根据这种多态性结合赤麂的SC特征 ,从细胞学水平进一步推断赤麂的性别决定相关区域位于染色体Y2 p或Y2 q上的近着丝粒区     

阿勒泰羊、藏绵羊(贾洛类群、欧拉类群)Sry基因序列分析及亲缘关系研究

利用山羊Sry基因设计引物,PCR扩增获得阿勒泰羊、藏系欧拉羊、藏系贾洛羊包含Sry基因整个编码区的雄性特异性片段.经测序及人工校对、剪切获得Sry基因编码区序列.分析结果表明三个类群羊Sry基因序列完全相同,且与其他品种羊具有高度的同源性:阿勒泰羊、藏系贾洛羊、藏系欧拉羊与普通绵羊、盘羊及摩弗伦羊具有相同的Sry基因序列,亲缘关系最近,其次是赤羊,最远是大角羊.这说明,这三个类群羊可能是由中国盘羊经当地居民长期人工选育而成的地方性品种(系).     

两重巢式PCR检测母体外周血中胎儿游离DNA

使用两重巢式PCR技术检测母体外周血中胎儿游离DNA,为非损伤性产前鉴定胎儿性别和诊断单基因疾病奠定基础.采用改良的chelex100方法提取60例孕龄为16~36周孕妇的外周血浆中游离胎儿DNA,依据NCBIX染色体长臂ATL1位点,Y染色体上DYS14位点序列,设计并合成引物,用巢式PCR同时扩增2个基因片段,以鉴定胎儿性别.结果表明:有ATL1位点和DYS14位点的扩增产物261bp和198bp鉴定为男性胎儿,而仅有261bp扩增产物鉴定为女性胎儿.均以真实出生性别进行确认后发现,此方法能有效提高检测特异性.两重巢式PCR能够简便并准确地鉴定胎儿性别,对单基因疾病特别是X-连锁遗传病的诊断有积极意义.     

应用FQ-PCR检测孕妇外周血中胎儿细胞含量

合成一对染色体单拷贝基因GAPDH特异的引物和一对Y染色体单拷贝基因SRY特异的引物,并合成两条特异性TaqMan探针,加等量的DNA到含有上述两个引物探针的PCR反应体系中,行荧光定量PCR,获得两种基因的定量值,通过这两种基因含量的比值,计算孕妇外周血中胎儿细胞含量.在30 μL FQ-PCR反应体系中,加入最少约0.05 ng 正常男性基因组DNA能够稳定地获得扩增曲线;在60例临床孕妇外周血标本DNA 的DCFQPCR扩增中有35例出现SRY扩增阳性,阳性率为58.3%;在这些标本中,GAPDH 基因Ct值范围在20~22之间;SRY 基因Ct值范围在33~40;经计算,胎儿细胞含量范围在1/10.4~1/10.6.     

利用妊娠奶牛血液快速鉴定不同发育阶段的胚胎性别

采集妊娠奶牛静脉血液,从血浆中提取胎儿DNA,利用牛Y染色体上性别决定基因（sex-determining region Ylinked gene, SRY gene）的特异性序列设计引物,应用巢式PCR扩增SRY基因特异性片段,同时以牛肌动蛋白（β-Actin）特异性片段的扩增产物作为内参照,对32头妊娠奶牛早期胚胎性别进行鉴定。结果表明：从不同妊娠期奶牛血浆中提取胎儿游离DNA进行胚胎性别鉴定的总准确率为80％,其中1～2月龄、2～3月龄、4～8月龄胚胎性别鉴定的准确率分别为60％、85．7％、92．3％。     

St染色体组ISSR分子标记的建立和应用

以中国春(CS)、绵阳11(MY11)等小麦为对照,以拟鹅观草(Pseudoroegneria spicata)、中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)、中国春茸毛偃麦草双二倍体(TE)为材料筛选100条ISSR引物,筛选到引物811能在拟鹅观草扩增出一条758 bp的特异DNA片段(GenBank登录号为EU368734),记为p811758.利用该引物对一系列含有St染色体组的二倍体或多倍体进行PCR扩增,结果显示含有St染色体的材料均可以扩增出p811758,小麦属的其他不含St染色体的物种不能扩增出p811758.以两套中国春-中间偃麦草二体附加系为材料进行初步染色体定位,结果表明所有材料均扩增出了这条特异带.进一步对中国春中间偃麦草后代进行扩增,结果表明p811758可以作为分子标记用来检测小麦背景中含St的染色质.     

错配PCR对牛X染色体相关基因杂合子的检测

利用DNA测序技术,在荷斯坦奶牛胎儿中找到X染色体基因GLRA2 3'端的杂合位点(C/T),设计错配引物在该位点对胎儿及其父本、母本基因组进行PCR扩增,建立起GLRA2基因的错配PCR技术,该技术可以快速在群体基因组中检测这一杂合位点.     

新Y染色体DYS651在山西汉族人群中遗传多态性调查

目的,通过对新的DYS651基因座在山西汉族群体的研究,获得该基因座的基因频率分布情况,为群体遗传学、法医学个体识别及亲子鉴定提供计算数据,对其在法医学上的应用进行可行性探讨。方法:在Y染色体基因组DNA中查找候选的基因座,用GenBank中的引物序列进行PCR扩增,再用银染方法显带。对其筛选的等位基因测序,构建等位基因分型标准物;按照ISFG原则命名各等位基因。结果:本研究选择了Y染色体基因座DYS651。在120例山西汉族无关男性个体血样中共检出了5个等位基因。其基因多样性为0.7768,在法医学应用方面,其个人识别能力(DP)和非父排出率(PE)均为0.7768。结论:新Y染色体基因座DYS651具有较高的遗传多态性,在法医学及人类遗传学方面具有应用价值。     

两对引物PCR扩增黑斑蛙Sox基因

以人的SRY基因的HMG-box保守区设计的两对引物,对黑斑蛙Sox基因的扩增.结果如下:1)雌雄黑斑蛙均扩增出一条带,大小约为220 bp,说明Sox基因的长度在黑斑蛙雌雄个体间无性别差异;2)两对引物的扩增结果相同,表明Sox基因有高度保守性.     

鲤鱼中5个Sox基因保守区的克隆和比较

SRY/Sry基因已被公认为是哺乳动物的睾丸决定因子(TestisDeterminingFactor,TDF)基因,它的正确的时空表达是雄性生殖腺形成的关键,即导致哺乳动物胚胎性别决定的开关基因.作为一个大基因家族的首位成员,它的发现诱发了Sox基因家族的研究热潮.Sox基因家族是在动物中发现的一类新的编码转录因子的基因家族,其产物具有一个HMG基序保守区,参与诸如性别决定、骨组织的发育、血细胞生成过程、神经系统的发育、晶状体的发育等多种早期胚胎发育过程.鱼类是脊椎动物中进化地位较低的一类生物,除了个别种类出现了与性别相关的染色体外,绝大多数都无异形性染色体,说明了鱼类正处于性别染色体进化的重要时刻.研究鱼类中的Sox基因对于研究SRY的发生、性别染色体的进化以及性别的决定机制有着重要的意义.本实验利用兼并引物PCR的方法,参照Sox基因的HMG-box区氨基酸序列设计简并引物,对鲤鱼(Cyrinuscarpio)的基因组进行扩增,获得5个新的基因片段.经过在Genbank中进行同源性比较和分析,证明它们是鲤鱼的Sox基因并分别命名为CcSox3、CcSox4、CcSox11、CcSox14、CcSox21.与鲤鱼中的这些Sox基因具有最高同源性的基因分别是OlSox3,同源性为94.03%;CvSox4基因,同源性为88.06%;DrSox11基因,同源性为97.01%;MmSox14和HsSox14基?     

与花椰菜(Brassica oleracea ssp.botrytis)抗黑腐病基因连锁的RAPD标记

利用 RAPD技术 ,在花椰菜 ( Brassica oleracea ssp.botrytis)抗感黑腐病的近等位基因系之间进行 1 0碱基随机引物的筛选 .34 5条 RAPD引物扩增的产物表明 ,有 7条引物在近等基因系中呈多态性 .进一步的重复实验表明 ,只有引物 OP2 2 4能够产生稳定的多态性 .为了确定扩增产物 OP2 2 4/1 6 0 0与抗黑腐病基因的连锁程度 ,利用 F2分离群体进行检测 ,结果表明 :花椰菜种质 C71 2抗黑腐病生理种 BJ的抗性由一对显性基因控制 .RAPD标记OP2 2 4/1 6 0 0与抗病基因连锁 ,其遗传距离为 ( 4 .5± 1 .37) c M     

单引物PCR扩增DNA指纹图谱的稳定性研究

以人胶原蛋白基因下游一段ＤＮＡ的互补序列设计引物，对人染色体ＤＮＡ进行单引物ＰＣＲ扩增，在低温退火的条件下，这种引物与ＤＮＡ模板的一处完全配对，并且可以随机地结合在其他一些位置上。由此进行单引物ＰＣＲ扩增，它们的扩增产物形成了稳定的引物－模板特异的ＤＮＡ指纹图谱。本文所建立的单引物ＰＣＲ扩增技术在类似的研究中均可获得稳定的实验结果，具有一定的应用价值。     

沼泽红假单胞菌GroE基因高保守区DNA片段的克隆,测序和特性分析

利用原核微生物GroE基因特定区域高保守性设计了简并引物，以Rhodopseudomonas palustris Y6的染色体为模板进行PCR扩增，得到片段594bp的产物，将该DNA片段连接到pUC-T载体多克隆位点上，转化大肠杆菌DH5α菌株，得到阳性重组子。经Southem 杂交验证，已克隆的594bpDNA片段来自Rhodopseudomonas palustris测序结果分析表明该片段是细菌groE基因高保守区。     

RAPD分子标记技术在高粱抗丝黑穗病研究中的初步应用

实验采用7050B(抗病)与TX622B(感病)杂交的F2感性个体的DNA及高粱丝黑穗病3073(抗病)、3049(感病)为试材.采用CTAB法提取高粱总DNA,用RAPD分子标记技术对其扩增的多态性及差异性图谱进行分析.实验结果如下:通过对电泳电压、电泳时间及点样量的筛选,建立并优化了RAPD-PCR琼脂糖凝胶检测系统;筛选了90个RAPD引物,其中30个引物扩增出清晰的多态性谱带,用这30个引物对3073(抗病)、3049(感病)2种试材进行抗丝黑穗病基因的初步分析,有11个引物扩增出多态性谱带.     

毛冠鹿与3种麂属动物的GAPDH基因序列的比较分析

麂亚科（Muntiacinae）动物包括麂属（Muntiacus）和毛冠鹿属（Elaphodus），分布于东南亚、中国及印度，动物形态相似，但具有令人瞩目的细胞遗传学特性．本文以赤麂（Muntiacus muntjak）、黑麂（Muntiacus crinifrons）、小麂（Muntiacus reevesi）和毛冠鹿（Elaphodus cephalophus）4种麂亚科动物为材料，以3-磷酸甘油醛脱氧酶（GAPDH，管家基因）为靶基因，对毛冠鹿在麂亚科中分类地位进行分子鉴定．提取这4种动物的基因组DNA，根据人的GAPDH基因设计引物，进行PCR扩增．获得了约为300bp的扩增产物．将纯化后的扩增产物克隆到质粒pMD18＋TVector中，转化DH-5a菌，挑选阳性克隆。用M13-47／RV—M通用引物进行测序．测序的结果经clustal软件进行了同源性比较．结果显示：麂属动物种问GAPDH基因间的DNA差异在2．52％～4．37％之间，毛冠鹿与麂属3种动物的差异在1．79％-2．87％之间．这些变异以碱基的转换为主．本文结果支持毛冠鹿为独立属1种的分类观念．     

三点苜蓿盲蝽线粒体Cyt b基因扩增条件研究

以三点苜蓿盲蝽为材料,采用SDS-蛋白酶K消化法提取其基因组DNA,利用CB-1、CB-2昆虫通用特异性引物对线粒体Cyt b基因433 bp片段进行PCR扩增,获得三点苜蓿盲蝽线粒体Cyt b基因的最佳扩增条件.