八肋游仆虫第一类肽链释放因子eRF1a多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

将八肋游仆虫第一类肽链释放因子基因eRF1a克隆入表达载体pRSETc,并在大肠杆菌Bl21(DE3)中进行诱导表达.表达形成的包含体经切胶回收,然后免疫大鼠制备抗血清.所获得的抗血清用Amersham Biosciences抗体纯化试剂盒进行纯化,SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的抗体纯度很高.Western blotting印迹和ELISA鉴定结果表明抗体特异性好,效价为1∶5000.     

八肋游仆虫eRF1a的C端是肽链释放因子eRF3的结合区(英文)

真核生物蛋白质合成终止需要两类肽链释放因子,eRF1和eRF3.研究表明八肋游仆虫的两类肽链释放因子在体内和体外都能形成复合物,且第一类肽链释放因子eRF1a与第二类肽链释放因子eRF3的C端结合.为了确定eRF3在eRF1a上的结合区,本研究以八肋游仆虫第一类肽链释放因子eRF1a基因为模板,用PCR的方法获得了N端分别截短140和206个氨基酸的eRF1a片段,同时在这两个片段的3'端融合了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列,将这两个序列分别插入原核表达载体pTWIN1,并构建重组表达质粒pTWIN1-eRF1aC1 his6和pTWIN1-eRF1 aC2his6,转入大肠杆菌BL21( DE3)中获得了可溶性表达,通过一步His60 Ni Superflow柱亲和层析,重组蛋白CBD-intein-eRF1 aC1 his6和CBD-intein-eRF1aC2 his6获得纯化.体外pull down分析显示eRF1aC1和eRF1aC2均能与八肋游仆虫第二类释放因子eRF3相互作用,这表明八肋游仆虫eRF1a的C端是肽链释放因子eRF3的结合区.     

八肋游仆虫小核中Rab1家族基因的分离及多态性分析

从八肋游仆虫小核中克隆筛选到7种E orab1基因,它们的同源性为94.5%~98.6%.将这7种小核E-orab1的M DSs(m acronuclear destined sequences)在NCB I网站进行BLA ST比对,发现7种小核E orab1的M DSs的四种M DSs序列有相对应的大核E orab1家族基因,据此4种小核E orab1依次命名为m iE orab1b,m iE orab1 ik,m iE orab1n,m iE orab1c.研究表明,大核中R ab1家族基因的多态性部分或全部来源于小核R ab1家族基因.     

八肋游仆虫中心蛋白的核磁共振研究

利用液体核磁共振方法对八肋游仆虫中心蛋白全长蛋白(EoCen),LC端结构域(EoCen-LC)和N端结构域(EoCen-N)进行了分析,并研究了蛋白与钙离子的相互作用情况.研究结果表明,未加入钙离子,全长蛋白,LC端结构域和N端结构域谱图重叠严重,峰型较差,说明未折叠成良好的三级结构,存在较大的构象交换或一定程度的聚集;与钙离子结合后全长蛋白,LC端结构域三级结构有所改善,但仍然无法用液体核磁共振方法进行进一步的结构研究.N端结构域与钙离子结合后谱峰分散性好,说明N端结构域具有较好的三级结构,能够应用核磁共振的方法进行结构解析.     

八肋游仆虫NMD途径因子的生物信息学分析及分子鉴定

无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)是细胞内基因表达调控的一种重要方式,以保障细胞内基因的精确表达,但无义mRNA被识别和降解的机制有待深入研究。文章利用同源序列比对,从八肋游仆虫大核基因组数据库中鉴定了11种NMD途径相关蛋白因子的基因序列,并预测了各个蛋白因子的功能结构域;利用蛋白质三级结构预测与分子对接技术,分析了八肋游仆虫eUPF1-CH与eUPF2-U1BD之间相互作用的关键氨基酸残基。利用定点突变和Pull-down实验证实,eUPF2可能通过其保守的αA-helix结构域与eUPF1相互作用。     

八肋游仆虫中ECD1基因的克隆及序列分析

含有CHROMO(chromatin organization modifier)结构域的蛋白参与了异染色质的形成及转录沉默复合物的形成.原生动物游仆虫细胞中既含有转录活跃的大核也含有转录沉默的小核.本实验应用PCR技术从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)中获得了一个编码含有CHROMO结构域的基因ECD1(Euplotes chromo domain-con-taining protein 1)(GeneBank登录号为FJ357578).大核中含有该基因的微小染色体全长1105 bp.小核中该基因内无内部删除序列IES的存在.通过RT-PCR,证实该基因开放阅读框为645 bp.大核基因中含有三个内含子,转录过程中这些内含子均符合一类内含子GU-AG剪切规则.DNAstar软件分析,该基因编码的蛋白质包含214个氨基酸,分子量24.7 kDa,等电点为5.48.结构域聚类分析表明Ecdl蛋白可能执行与四膜虫异染色质蛋白Pddlp和Pdd3p相似功能,参与大核发育过程中异染色质的形成和IES序列的删除.     

八肋游仆虫核糖体蛋白P1A磷酸化位点分析

为了探讨单细胞真核生物八肋游仆虫酸性核糖体蛋白P1(EoP1)的磷酸化作用,对EoP1的一个亚型EoP1A进行了磷酸化位点分析。通过在线软件预测EoP1A的磷酸化位点,根据预测结果进行定点突变,随后对EoP1A野生型及突变体分别在大肠杆菌中进行了表达纯化。利用核磁共振(NMR)检测EoP1A的体外磷酸化作用,结果表明位于蛋白N端的第8位丝氨酸(Ser8)为CK2磷酸化EoP1A蛋白的磷酸化位点。     

八肋游仆虫信息素在大肠杆菌中的表达

信息素在八肋游仆虫接合生殖过程中起着重要的诱导配对作用，为了进一步研究其诱导机制，根据已知的基因序列，应用PCR技术，扩增信息素G3基因，并将该基因插入表达载体pGEX-6P1中，构建了重组表达质粒pGEX-6P1-G3．重组菌在37℃下，经1．0mmol／L IPTG诱导，12％SDS-PAGE分析，在37kDa处出现明显的特异目的带。     

伍氏游仆虫皮层微管类细胞骨架的荧光标记

Flutax直接荧光标记和抗α微管蛋白间接免疫荧光标记显示:伍氏游仆虫皮层细胞骨架是以微管为主要成分组成的各纤毛器骨架和骨架附属微管,以及与非纤毛器骨架相互联系形成的立体骨架.整个皮层骨架包括口围带、波动膜、额腹横棘毛、尾棘毛和背纤毛等纤毛器及其骨架、纤毛器基部附属微管和其他皮层微管骨架.伍氏游仆虫细胞背、腹面存在网格结构;细胞背面存在成列的空洞样结构;毛基体周围的玫瑰花样强荧光标记,呈现更加精细的网格结构.结果揭示:与其他腹毛类纤毛虫相比,游仆虫纤毛器有了明显的功能上的"分工";细胞背腹面存在的网格是游仆虫细胞表面的真实结构,是游仆虫细胞皮层微管类细胞骨架的一部分;细胞背面的空洞样结构及毛基体周围的更精细结构,揭示出毛基体基部存在着更加复杂的微管骨架.所得结果有利于进一步揭示微管类胞器的功能.     

P-5m八肽多克隆抗体的制备及应用

目的制备P-5m八肽的多克隆抗体并进行初步鉴定和应用,为研究P-5m八肽的功能及作用机制获得重要的实验工具.方法将9-氟甲氧羰基(Fmoc-)固相合成法合成的P-5m八肽纯化后与载体蛋白-血蓝素联接;取偶联后的多肽皮下注射免疫新西兰白兔,并加强免疫得到抗血清,以C18反相色谱分离柱分离纯化;通过间接ELISA方法测定血清效价;利用Transwell实验和Western blot方法初步鉴定多克隆抗体拮抗P-5m八肽抑制肿瘤细胞转移的效果.结果纯化后的抗体经间接ELISA测定效价均大于1∶160 000,表明获得高效价的多抗;通过Transwell实验证明该抗体能够封闭P-5m对肿瘤细胞侵袭的抑制能力;通过Western blot方法证实此抗体效价较高,特异性较强;该多克隆抗体能够封闭P-5m在SW620细胞中上调E-cadherin表达的作用,并阻遏P-5m对MMP-2和MMP-9表达的下调作用,与对照组比较差异具有统计学意义(P0.05).结论 P-5m多克隆抗体可用于Transwell和Western blot等实验,为研究P-5m八肽的功能及抗肿瘤转移作用机制提供实验依据.     

包囊游仆虫细胞的类中间纤维细胞骨架体系

应用生化分级抽提,并结合DGD包埋 去包埋透射电镜样品制备方法显示,包囊游仆虫营养细胞和休眠细胞中,均存在由直径10 nm左右的单根纤维及单根纤维聚集成的纤维束为结构单元形成的类中间纤维细胞骨架体系.其中,营养细胞的类中间纤维构成的细胞质三维网架,在细胞膜内缘以较密集的纤维网占有了整个表质层,在表质层内缘的细胞质深部纤维形成较松散的网络,网内常见附着有细胞器及一些电子密度颗粒;核纤层位于大核核膜内缘,纤维紧密聚集成网;核骨架纤维网分布比较致密,未见有电子密度颗粒附着.休眠细胞中含有与营养细胞相似的纤维网架结构,但位于细胞内不同层次的纤维网比营养细胞中的同种结构要致密得多,这可能与纤毛虫形成包囊时细胞大范围的收缩有关.并且值得注意的是,在休眠细胞包囊壁的内层壁中也观察到相似于中间纤维的纤维网络,其纤维网均匀和致密地分布在整个包囊壁层中.电泳图谱显示,纤毛虫形成包囊后,保留了营养细胞中的部分蛋白条带,失去了部分条带,新产生了一些特异的条带.结果表明,包囊游仆虫的类中间纤维 核骨架体系,是细胞在营养条件下和休眠状态下都稳定存在的结构,它可能起到比微管类骨架更重要的作用.并且休眠细胞中该体系产生的一些特异蛋白条带,可能是纤毛虫休眠生命活动中的重要蛋白.     

三聚氰胺多克隆抗体的制备及鉴定

用三聚氰胺偶联蛋白为抗原,按不同的时间规律及抗原剂量对成年兔进行免疫,获得特异性的三聚氰胺多克隆抗体.效价检验应用蛋白质电泳和间接ELISA方法.应用10%及12.5% SDS-PAGE,验证血清中IgG抗体的产生情况,再用间接酶联免疫吸附试验测得第4次免疫后抗体效价达到1.2×107.此法易于实施,且获得的血清样品具有较高的效价,为今后三聚氰胺多克隆抗体的分离纯化提供了可靠的实验依据.     

重金属铅多克隆抗体的制备及纯化

制备重金属铅完全抗原,进而制备和纯化重金属铅的多克隆抗体.使用双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA、Pb2+标准溶液和牛血清白蛋白(BSA)制备重金属铅的完全抗原Pb-DTPA-BSA;运用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法判断完全抗原Pb-DTPA-BSA是否合成成功,并应用紫外分光光度计测定免疫抗原Pb-...     

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

卵形鲳鲹TNFSF6的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备

为了研究卵形鲳鲹肿瘤坏死因子配体6(TNFSF6)的功能,本研究构建了TNFSF6的原核表达载体并制备了其多克隆抗体,首先通过PCR扩增技术扩增获得了TroTNFSF6的开放阅读框序列,并构建了原核表达重组质粒pET-TroTNFSF6,随后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21中,进行原核表达并获得重组蛋白rTroTNFSF6.结果显示,重组蛋白rTroTNFSF6大小约46.5 kDa,其最适诱导温度为20℃,诱导时间为8 h,IPTG的最佳浓度为0.6 mmol/L.可溶性分析表明,重组蛋白rTroTNFSF6主要在沉淀中,以包涵体的形式存在.将纯化后的重组蛋白rTroTNFSF6免疫小鼠以制备多克隆抗体,ELISA检测结果表明其效价高达1∶32 000.本研究为进一步探究卵形鲳鲹TNFSF6的功能奠定了基础.     

兔抗PEB1多克隆抗体的制备及鉴定

摘要：【目的】利用纯化的空肠弯曲菌表面蛋白PEB1,制备其多克隆抗体。【方法】用PEB1蛋白作为抗原免疫兔,分离血清得到兔抗PEB1多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价,并用Western-Blotting验证。【结果】PEB1蛋白免疫兔后,得到了兔抗PEB1多克隆抗体,间接ELASA法检测表明兔抗PEB 1血清效价达到1：10 000,Western印记检测表明,该抗体能与PEB1蛋白发生特异性结合,其特异性与敏感性均较好。【结论】获得了高效价的PEB1多克隆抗体。     

斑马鱼CFL基因的克隆、多克隆抗体的制备及分析

在心脏发育过程中,相关基因的正常表达是有功能心脏形成的关键．斑马鱼CFL基因是从斑马鱼胚胎的cDNA文库中克隆出来的一个心脏发育候选基因．生物信息学分析表明：CFL基因编码278个氨基酸,含有一个CXXC结构域．为进一步研究该基因的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了该基因．将所得片段插入原核表达载体pET-28a载体中,经测序鉴定正确后转化入Rosetta菌株中,用IPTG诱导表达出pET-28a－CFL融合蛋白,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71％,融合蛋白相对分子质量约为30kD．经包涵体纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体．经验证,具有较好的特异性和较高的效价,可以用作western－blot免疫印迹等实验分析．     

纤毛虫阔口游仆虫(Euplotes eurystomus)微管类细胞骨架的超微结构

采用透射电镜术显示腹毛类纤毛虫阔口游仆虫(Euplotes eurystomus)的微管类细胞骨架包括纤毛器微管骨架和非纤毛器微管骨架.结果表明:细胞皮层纤毛器中除纤毛杆、纤毛基体微管外,其基体间连接纤维、基体托架、基体附属微管、纤毛器基部附属微管束以及围棘纤维篮等也是皮层纤毛器微管的重要组成部分,各种微管相互联系、聚...     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

Rab39A多克隆抗体的制备与鉴定

制备抗人Rab39A多克隆抗体并进行纯化检测,以用于Rab39A功能的研究.选取免疫原性强且特异性高的羧基端42个氨基酸(176～217aa)作为目的片段.PCR法扩增并构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rab39C42.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化GST-Rab39C42融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体.然后以亲和层析法纯化抗体,利用Western blot和免疫荧光检测抗体的特异性.结果表明,构建的原核表达载体经IPTG诱导后高效表达GST-Rab39C42蛋白,纯化后抗体质量浓度为1μg/μL;Western blot实验显示,抗体可以识别外源Rab39A蛋白和多个细胞系的内源Rab39A蛋白;抗体中和实验和RNA干扰实验证明了该抗体具有特异性.本研究成功构建了pGEX-4T-1-Rab39C42原核表达载体,并制备了特异性的抗人Rab39A兔多克隆抗体,为进一步研究Rab39A的功能提供了有力的支持.