大肠杆菌中心人钠素基因在PL和T7启动子控制下的…

将Ｐ１噬菌体的ｒｅｆ基因与人心钠素的嵌合基因ＲＥＦ－ＡＮＰ分别克隆入带ＰＬ启动子和Ｔ７启动子的两种表达载体，获得高铲表达重组质粒ｐＺＪＭ１和ｐＺＪＭ４．ｐＺＪＭ１转化ＤＨ５α，ｐＺＪＭ４转化ＨＭＳ１７４，在表达细菌培养到ＯＤ６００＝０．２５时分别进行温度诱导和化学诱导，快速凝胶扫描结果表明ＲＥＰ－ＡＮＰ表达量各占细菌可溶性总蛋白的６７．１％和２８．１％；在ＯＤ６００＝１．０或２．０时进行诱导，均能     

利用噬菌体T7RNA聚合酶在大肠杆菌（E.coli）中引导人…

我们将人尿激酶原因重组到含Ｔ７基因ψ１０启动子的质粒中，用异丙基硫代半乳糖苷诱导，在大肠杆菌的ＢＬ２１菌株中进行表达。经纤维蛋白平板测活法测得表达产物存在于包体中。经变性和复性处理后，表达量达每升培养液１６００ＩＵ。用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法鉴定表达产物为单一条带。分子量在４３ｋＤａ左右，略低于天然５４ｋＤａｐｒｏ－ＵＫ这可能与Ｅ．ｃｏｌｉ中缺乏糖基化酶有关。     

β—actin启动子控制的人尿激酶原基因在CHO细胞中…

本文将人尿激酶原ｃＤＮＡ基因插入到含β－肌动蛋白启动子的表达载体中，通过脂质体转化到中国仓鼠卵巢细胞内，经筛选得到稳定表达ｐｒｏ－ＵＫ基因的细胞株，用ＥＬＩＳＡ检测到细胞培养液中表达量为２－３ｍｇ／Ｌ。经过抗尿激酶的免疫亲和柱初步纯化细胞培养上清后得到表达产物。同时，在培养液中加入佛波酯ＰＭＡ后，发现它对目的基因的表达有促进作用。     

T7 DNA 聚合酶基因的改造及其在大肠杆菌中的表达

用聚合酶链式反应技术,从Ｔ７噬菌体中选择扩增编码Ｔ７ＤＮＡ滞酶５’→３’聚合酶的基因序列,扩增片段利用引入的酶切位点克隆至载体ＰＳＫ上,从而得到了不含有３’→５’外切酶基因的Ｔ７ＤＮＡ聚合酶基因,并将该重组基因克隆至原核表达质粒ｐＥＴ２８ａ上,在大肠杆菌中进行了表达。     

人尿激酶原在大肠杆菌中表达的研究

用限制性内切酶将人尿激酶原cDNA酶切成一系列基因片段,并分别在大肠杆菌中表达。发现其中1个富含大肠杆菌稀有密码子AGG(精氨酸)的片段表达量低,成为人尿激酶原cDNA在E.coli中高效表达的限制因素。将富含AGG(精氨酸)的片段在E.coliBL21-CodonPlus^TM-RIL中表达,通过该菌株引入dnaY基因(即tRNA_agg/aga(Arg))使该片段的表达量提高了10倍。最后用同样的方法提高全长人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的表达量,使其表达量达到全菌蛋白的5%。     

利用噬菌体T＿7RNA聚合酶在大肠杆菌（E．coli）中引导人尿激酶原克隆基因的表达

我们将人尿激酶原基因（ｐｒｏ－ＵＫ）重组到含Ｔ＿７基因１０启动子的质粒（ｐＥＴ３ｃ）中，用异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）的ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中进行表达。经纤维蛋白平板测活法测得表达产物存在于包含体中。经变性和复性处理后，表达量达每升培养液１６００ＩＵ．用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法鉴定表达产物为单一条带。分子量在４３ｋＤａ左右，略低于天然５４ｋＤａｐｒｏ－ＵＫ。这可能与Ｅ．ｃｏｌｉ中缺乏糖基化酶有关。     

人尿激酶原变体(K151E,R154G)在家蚕中的高效表达

Ｔｈｅｓｉｌｋｗｏｒｍｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｓａｗｅｌｌ ｋｎｏｗｎｅｃｏｎｏｍｉｃａｌｗａｙｏｆｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇｒｅｃｏｍ ｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ .Ｉｎｔｈｉｓｌｅｔｔｅｒ ,ｔｈｅｃＤＮＡｏｆａｍｕｔａｎｔｏｆｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ(ｒｓｃｕ ＰＡ) ｇｅｎｅ ,ｍｓｃｕ ＰＡ(Ｋ1 5 1Ｅ ,Ｒ1 5 4Ｇ) ,ｗａｓｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｏｉｎｃｌｕｄｅｔｈｅｎａｔｕｒａｌｕｒｏｋｉｎａｓｅ(ｕ ＰＡｏｒＵＫ)ｓｉｇ…     

φ10启动子控制下大肠杆菌中rhNTA表达的乳糖诱导

采用乳糖作为诱导物,对φ启动子控制下重组蛋白rhNTA（a new thrombolytic agent）在大肠杆菌中的表达进行研究,结果为培养12h（诱导6h）后湿菌体重量86．0－100．2g/L、目标蛋白占细胞总蛋白的40％－50％。研究了关键基质组分、乳糖诱导等对表达的作用。结果表明,基础料和补充氮源中酵母膏的比例、诱导时机和乳糖流加方式等对表达量的提高有明显的影响。实验显示,采用乳糖诱导时重组蛋白的可溶性部分占有较大的比例。     

dna Y基因产物提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的表达

对提高人水激酶原ｃＤＮＡ在大肠杆菌中的表达水平进行了研究。通过ＰＣＲ方法在其结构基因５‘端添加起密码子ＡＴＧ，用人工合成的不依赖于ρ因子的终止序列替换 ３’端非翻译区，得到完整的人尿激酶原结构基因。将其克隆在表达质粒ｐＫＫ２３３－２中，转化大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＡ２２１，人尿激酶原得到初步表达，但表达水平很低，原因可能是人尿激酶原ｃＤＮＡ富含真核细胞偏爱的密码子，而大肠杆菌中识别这些密码子的ｔＲＮ     

β－actin启动子控制的人尿激酶原基因在CHO细胞中的表达

本文将人尿激酶原（ｐｒｏ－ＵＫ）ｃＤＮＡ基因插入到含β－肌动蛋白（ａｃｔｉｎ）启动子的表达载体中，通过脂质体转化到中国仓鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞内，经筛选得到稳定表达ｐｒｏ－ＵＫ基因的细胞株，用ＥＬＩＳＡ检测到细胞培养液中表达量为２～３ｍｇ／Ｌ。经过抗尿激酶（ＵＫ）的免疫亲和柱初步纯化细胞培养上清后得到表达产物。同时，在培养液中加入佛波酯ＰＭＡ后，发现它对目的基因的表达有促进作用。     

Establishment of a coupled expression system mediated by modified T7 RNA polymerase gene

A coupled expression system for plants wasmerase gene was modified by addition of the coding sequenceof nuclear location signal from SV40 large T antigen. Plantexpression vector pBBT7 was constructed with the modifiedT7 RNA polymerase gene under the control of CaMV35Spromoter. Another expression vector pBTG contained cas-sette of gusA controlled by T7 promoter. The two vectorswere co-transformed into tobacco via the Agrobecte-rium-mediated method. Results of GUS activity indicatedthat the co-transformed plant with pBBT7 and pBTGshowed a high level of GUS activity. The results demon-strated that the coupled expression system of T7 polymeraseand T7 promoter was workable in plants.     

人WDR79基因启动子表达载体的构建及鉴定

人WDR79是一种重要的支架蛋白,在端粒酶组装、卡哈尔体(Cahar body)形成和DNA损伤修复等过程中发挥着重要作用。采用PCR扩增技术获得人WDR79基因启动子上游DNA序列,构建人WDR79基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-WDR79-promoter;通过双酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA测序和荧光素酶活性测定等实验手段,验证质粒pGL3-WDR79-promoter构建的正确性及其表达活性。本研究结果为进一步探讨人WDR79基因表达的调控机制奠定实验基础。     

人尿激酶原纤原受体识别区嵌合突变体的构建与表达

采用同源转座方法,构建了在尿激酶原K区138～139位点插入了赖氨酸甘氨酸天冬氨酸(KGD)序列的2种尿激酶原嵌合体基因(proUK-KGDW, proUK-KGDS),并以昆虫细胞SF9为宿主获得了高效表达,表达量在33.34 μkat·mL-1, 细胞密度为106·mL-1,表达高峰期表达产物占细胞总蛋白的15%以上.表达产物展示出较高的纤溶活性,并具有良好的人尿激酶原免疫原性,同时,经SDS-PAGE试验检测,昆虫细胞分泌的突变体相对分子质量符合理论预期,为5.4×104,绝大多数为单链态形式.经过离子交换、分子筛层析及超滤浓缩等步骤对突变体蛋白进行了初步纯化,光浊度法试验表明含有KGDW序列的尿激酶原突变体具有较强的血小板聚集抑制活性,而含有KGDS序列的突变体几乎不具有任何活性,表明羧基端边侧序列对KGD展示正常的受体结合活性影响较大.溶解圈试验表明2种突变体均保留了较高的纤溶活性,说明插入序列不影响尿激酶原的酶切活性.     

rhBMP-6的表达和纯化

骨形态发生蛋白(bone　morphogenetic protein，BMP)—6属于转化生长因子(transforming growth fac-tor)—β超基因家族，在骨的形成中具有重要作用，并受雌激素选择性上调．本研究利用RT—PCR从人胎盘组织中扩增BMP—6成熟肽的DNA片段，克隆到pGEx—5x—1中，构建GST—BMP6融合蛋白表达载体pGEx—BMP—6，转化E.coli DH5a．克隆质粒转化的工程菌，经IPTG诱导4h后，高效表达GST—BMP6融合蛋白，在SDS—PAGE上出现一新蛋白带，分子量约为42kD，约占总蛋白的25％，表达产物以包涵体形式存在．菌体超声破碎，经0．3％N—十二烷基肌氨酸钠(SKL)溶解包涵体，离心后的上清液加入0．6％　Triton　x—100整合SKL，然后利用谷胱甘肽Sepharose—4B亲和层析纯化．结合GST—BMP6的介质经洗涤、xa因子酶切得到纯度达95％的rhBMP—6蛋白。     

人纤溶酶原Kringle 1 结构域在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化

Ｐｌａｓｍｉｎ(ｏｇｅｎ)ｗａｓｋｎｏｗｎｆｏｒｉｔｓｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｓｗｅｌｌａｓｉｔｓω ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ.Ｏｎｅｈｉｇｈａｎｄ 4ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎ .Ｃｏｎｃｕｒ ｒｅｎｔｌｙ 5ｈｉｇｈｌｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｔｒｉｐｌｅｌｏｏｐｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｎａｍｅｄａｓｋｒｉｎｇｌｅｄｏｍａｉｎｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｆｏｒｍｉｎｇ…