水稻OsDTH10基因CRISPR/Cas9编辑突变体的创建及功能分析

为了探究OsDTH10基因在水稻生长发育及开花中的作用,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsDTH10基因进行定向编辑.在OsDTH10基因的第4个外显子处设计sgRNA的靶位点,通过PCR扩增与Os U6SK空载体连接形成OsU6SK-sg RNA融合载体,再将获得的sg RNA和Cas9连接到植物双元载体pCAMBI1300中,得到重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10.利用农杆菌介导的植物转化法得到转基因植株,对其进行鉴定并测序.本研究共获得3个株系8株转基因植株,测序结果显示,2号株系的4株转基因植株由于发生了单碱基的插入,基因测序出现了套峰.田间表型观察发现,2号株系的4株T0代转基因植株抽穗期早于空载体对照,获得的T1代转基因植株抽穗期比对照的提早8 d.这些结果表明,重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10成功实现了对水稻OsDTH10基因的定向编辑.     

水稻中5个FT-Like家族成员的基因编辑突变体的创建与分析

为了揭示水稻中FT-like亚家族成员的生物学功能,采用CRISPR/Cas9技术对其中的OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7和OsFTL11进行基因编辑.在5个基因的编码区各选择1个靶点构建1个融合的sgRNA表达框,将表达框装载到CRISPR/Cas9表达载体中,通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻...     

一个新的水稻矮秆突变体sd-sl的遗传与基因定位研究

新的矮秆基因的发掘、研究和利用对水稻育种和植物生长发育机制研究有重要的作用.用60Coγ射线辐照粳稻9522,获得一个能稳定遗传的突变体.该突变体表型为株高较野生型矮,叶片短而微卷.将该突变体与籼稻广陆矮杂交,F2代呈3∶1分离,说明该突变体受隐性单基因控制.通过InDel分子标记对F2代分离群体进行遗传定位,将该基因定位于第6染色体InDel标记OS604附近.随后又发展了多对有多态性的InDel分子标记,将该基因座位精细定位在InDel标记XL6-6和XL6-1之间,AP003490和AP005619上,两个引物之间的物理距离为118 kb.本研究为该克隆基因及其作用机理的探究奠定了基础.     

利用CRISPR-Cas9系统高效创制水稻品系“17318”的 OsGW2、OsGN1a基因定向突变体

CRISPR-Cas9系统在水稻功能基因的功能研究、性状改良与分子设计育种中起着重要的作用。本研究成功构建了水稻高效定向敲除OsGW2和OsGN1a的CRISPR/Cas9载体pZJP049。并将该载体通过农杆菌介导转化水稻"17318"愈伤,获得水稻再生苗。PCR扩增的方法进行转基因植株阳性检测,结果显示阳性率为100%。PCR-RFLP结果表明OsGN1a基因位点的突变效率为77.7%。PCR-SSCP检测结果显示OsGW2基因位点突变率为100%。双基因聚合突变体(gw2gw2gn1agn1a)的种子在长度和宽度均有明显增加,与预期一致。本研究通过CRISPR-Cas9系统快速聚合Gn1a, GW2基因,实现了目标性状的精确改良。     

水稻早抽穗突变体zc1的表型分析及候选基因鉴定

从水稻T-DNA插入突变体库中筛选了一个早抽穗突变体zc1.为了克隆突变基因,对突变体株系进行了遗传分析,发现早抽穗表型和T-DNA共分离.利用热不对称交错PCR技术,扩增了T-DNA的侧翼序列.经序列比对发现,T-DNA插入到了一个富亮氨酸类受体激酶(LRR-RLK)基因的外显子区,造成了基因功能的丧失.候选基因的克...     

水稻白化突变体alb21生理特性和基因定位

高等植物叶绿体的正常发育需要叶绿体基因和核基因相互协调,这些基因的突变将导致叶绿体发育的缺陷．通过同位素诱变,获得了1例水稻的白化突变体alb21,其在幼苗时期就表现出白化性状,生长1个月左右逐渐死亡．遗传学分析表明,该突变属于单基因隐性突变;电镜观察表明,突变体细胞内完全丧失了叶绿体结构,只有一些空泡状的结构．突变体中既没有检测出叶绿素a或b,也没有检测出叶绿素合成的前体——原脱植基叶绿素a,说明此突变体的叶绿素合成途径受阻．因此,推测Alb21基因的突变,导致叶绿体发育受阻,叶绿素a或b以及叶绿素合成的前体——原脱植基叶绿素a不能合成．利用本实验室开发的水稻InDel分子标记,将该突变基因定位在第3条染色体上分子标记R3M51—2与R3M52—5之间约1520kb范围内．这些结果为该基因的克隆及叶绿体发育过程中的功能研究奠定了基础．     

中国强优势杂交水稻创制与应用

 在国家高技术研究计划（863计划）支持下,中国强优势杂交水稻研究取得一系列重要成果,连续创造了世界大面积水稻单产纪录,继续保持在水稻杂种优势利用领域的国际领先地位。本文对“十一五”末以来中国强优势杂交水稻创制与应用进行了总结,包括强优势杂交种育种理论和技术、重要功能基因挖掘与开发、强优势亲本和杂交种创制、强优势杂交种产业化技术、强优势杂交种的研究示范与推广应用等方面,展望了未来5年强优势杂交水稻研究的重点。     

一个水稻抗纹枯病突变体的遗传分析及其基因的初步定位

高水平抗纹枯病突变体和高感纹枯病品种蜀恢881杂交构建分离群体,经F2分离世代的遗传分析,抗、感单株比例符合3 1(χc2=0.563,χ12,0.05=3.84),初步确定该突变体对纹枯病的抗性由一对显性主效基因所控制,命名为Rsb-2(t)。利用已合成的530对微卫星引物,对抗纹枯病突变体和蜀恢881进行多态性引物筛选,用多态性引物对上述F2分离群体的全部感病单株和部分抗病单株的DNA进行PCR分析,借助MAPERMAKER/EXP3.0软件,对其微卫星标记实验数据进行连锁分析,将Rsb-2(t)定位于第3染色体的p臂,发现RM218、RM251、RM4321和RM5748与Rsb-2(t)连锁,它们均位于着丝粒端,连锁距离分别为32.1 cM,41.1 cM,42.4 cM和49.7 cM。研究结果为进一步对该基因的精细定位奠定了基础。     

一个水稻白化致死突变体abl25鉴定及其基因定位

经Co60辐照的粳稻嘉花1号得到一个新的致死白化突变体albino lethal 25(abl25),该突变体从发芽至4叶期表现为白化苗,之后逐渐死亡.与野生型嘉花1号相比,abl25突变体的叶绿素含量和类胡萝卜素的含量大大降低,叶绿体结构不正常,说明其叶绿体发育受到严重阻碍,导致植物死亡.遗传分析表明:该突变体受一对隐性核基因(abl25)控制,进一步利用abl25与广占63S杂交的F2分离群体,将该突变体基因(abl25)定位于第2染色体上SSR标记RM424与Indel分子标记ID7330之间,随后利用新开发的分子标记和扩大群体将其定位在Indel分子标记ID9111和ID9261之间的150 kb内,发现abl25是一个新的水稻苗期白化致死基因.     

水稻矮化突变体G蛋白α亚基基因的结构和表达

利用γ-Co60辐射诱发水稻特光矮-2(Oryza sativa L.cv.TGA-2)产生变异,获得一种稳定遗传的新型水稻矮化突变体dwarf69.dwarf69和TGA-2及其杂交后代F1、F2、F3成熟期的株高数据表明矮化表型受一对隐性基因控制.进一步研究发现,虽然dwarf69和TGA-2的G蛋白α亚基基因(Rice G protein alpha-subunit,RGA)编码区核苷酸序列只有一个核苷酸的差异,但RGA在野生型TGA-2中的表达量明显高于在突变体dwarf69中的表达量.对矮化突变体dwarf69和野生型TGA-2的RGA基因5＇上游区的序列分析表明,dwarf69 RGA 5＇上游区比TGA-2RGA5＇上游区多出1076bp.首次报道水稻矮化突变体中的RGA5＇上游区序列与其野生种的RGA5＇上游区序列存在显著的差异.     

基于荧光标记双向筛选的拟南芥CRISPR基因编辑突变体库构建

突变体库是研究基因功能的重要工具。拟南芥种质资源库(ABRC)储藏了几乎涵盖所有基因的突变体材料,其中T-DNA插入突变体占绝大多数。然而,当在T-DNA插入突变体中进行遗传转化或与其他转基因报告系统进行杂交时容易引起转基因沉默,阻碍了相关研究的开展,甚至产生错误结论。甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS)诱变和快中子诱变技术可获得非转基因突变体,但这两种方法均为随机诱变技术,需要通过基因定位来确认突变位点,无法实现基因靶向敲除。CRISPR/Cas9可以对目的基因进行靶向编辑,获得不携带转基因的突变体。拟南芥中尚无利用CRISPR/Cas9进行高通量突变体库构建的报道。本研究共设计900条sgRNAs靶向300个RNA通路相关基因,通过合成sgRNA混池文库、引入DsRed2荧光筛选标记、将DNA条形码和二代测序技术相结合,实现了对转基因阳性苗的高通量鉴定和分型,并对T2代具有发育缺陷的无荧光植株进行负向筛选,成功鉴定到了不含转基因的smd3-b和rlua4突变体。     

EMS诱发水稻早熟突变体

用0.5%EMS(甲基磺酸乙酯)溶液,在温度20℃下,处理水稻品种 IR-8的种子8小时。处理后,种子再用水冲洗,并播种。在 M_1中分离出低结实率和茎秆较短的植株。在 M_2中,这类植株分离成104个正常植株和4个早熟植株。这些早熟植株的开花和成熟天数较对照早28天。这些突变植株的叶片色泽是较深的,一穗在7天内就可成熟,而对照植株的穗子要在10天内才能完全成熟。突变植侏的形态特征几乎与对照植株无区别。突变植株在 M_3中全部为早     

一个新的水稻幼苗黄叶突变体的遗传分析及其基因的初步定位

在60Coγ射线辐照的水稻突变体库中,发现了一个以粳稻品种日本晴为遗传背景的幼苗叶色黄化突变体syl11(seedling yellow leaf 11).与野生型相比,突变体幼苗第二和第三叶表现黄色,在其完全展开之前叶片自其顶端开始转绿,长到四叶期其叶色恢复正常;并且该突变体syl11幼苗黄色叶片光合色素含量明显下降.遗传分析表明,该突变体的遗传性状由1对隐性核基因控制.本研究以培矮64S/syl11的F2代突变型植株作为定位群体,应用微卫星(SSR)分子标记以及新发展的InDel分子标记,将基因syl11定位在水稻第11号染色体长臂上的RM26652和处于着丝粒附近的ID11974分子标记之间,其遗传距离分别为0.5 cM和0.7 cM.     

水稻矮化突变体差异表达cDNA片段的克隆与分析

利用抑制性消减杂交（Suppressive subraction hybridization,SSH）分离本实验室获得的一株水稻矮化突变体dwarf69与其野生型对照品系特光矮-2（Rryza sativa,TGA-2 indica）间表达有差异的cDNA片段,分别以dwarf69作为驱赶子,TGA-2为检测子,以及以dwarf69作为检测子,TGA-2为驱赶子建立了两个差异表达cNDA文库,分别代表在TGA-2和dwarf69中特异表达的cDNA,经反式Northern检测这两个文库共得到10个阳性克隆。     

水稻“9311”突变体库的氯酸盐毒性筛选与分析

【目的】用氯酸盐筛选水稻(Oryza sativa)突变体库,分析氯酸盐对水稻的毒性。【方法】使用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulphonate,EMS)处理水稻材料“9311”种子,构建完成了水稻“9311”突变体库。【结果】通过水培法并利用氯酸盐的特性对诱变材料进行筛选,共筛选了2 361份诱变M2代材料,且与野生型相比获得了40份对氯酸盐表现差异敏感的材料。【结论】研究结果为进一步的材料创建与相关基因克隆提供了基础,也为水稻硝酸盐吸收与转化相关分子机理的研究奠定了基础。     

水稻雄性不育突变体ms102的鉴定和基因定位

OsMYB80是水稻花药和花粉发育过程中的重要转录因子,其下游靶标基因的相关研究仍有待补充。该研究从可能受OsMYB80直接调控的基因中筛选出24个可能参与信号转导、泛素化修饰、囊泡运输和未知功能的候选基因,利用qRT-PCR验证其表达模式,并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对其中7个基因(LOC_Os06g11930、LOC_Os09g26470、LOC_Os01g04409、LOC_Os06g35160、LOC_Os06g11135、LOC_Os05g13650、LOC_Os01g14880) 加以敲除。经I₂-KI花粉染色分析和结实情况考察发现,上述7个基因敲除后对植株育性影响都不显著,说明上述7个基因并非OsMYB80下游调控花粉育性的关键基因。这些结果也暗示某些受OsMYB80调控的下游基因及其参与的生物化学反应可能在花药花粉发育过程中功能冗余或者只发挥微效作用。

     

水稻卷叶矮化突变体rld的表型鉴定及基因精细定位

为了研究引起水稻叶片卷曲的分子机理,鉴定出新的水稻卷叶基因.用~(60)Co-γ射线辐射诱变籼稻品种镇恢084,获得一份卷叶矮化突变体材料,命名为rld(rolling leaf and dwarf).通过形态学分析水稻表型,石蜡切片观察叶片细胞组织形态,图位克隆和测序技术进行精细定位和确定目的基因,生物信息学分析蛋白序列结构.结果显示:rld突变体叶片极度内卷,株高降低,穗长变短,结实率降低;rld突变体叶片维管束间的下表皮叶肉细胞面积增大;rld基因精细定位在标记Indel2和Indel5间的32.3 kb的物理区间,测序发现rld是调控卷叶基因RL9的一个新等位基因,由于外显子上精氨酸缺失引起rld基因编码的蛋白空间结构发生改变.推测精氨酸在RL9蛋白的正常功能行使过程中是必要的,对维持水稻叶片表型具有至关重要的作用.     

水稻基因结构分析与预测建模

将水稻基因结构预测问题划分为基因级、元件级和特征级等多个层次上的一系列较简单子问题,分析了各特征与序列C G含量之间的依赖关系,通过采用从简单到复杂逐级优化的策略建立了不同序列C G含量的水稻基因结构模型,设计了基因结构寻优的动态规划算法,开发了水稻基因结构预测软件Rice-GenePRE.采用测试数据集OsSNG550对该软件进行测试的结果显示:RiceGenePRE在核苷酸、外显子和基因水平上的预测效果均优于水稻基因结构预测系统FGENESH.     

水稻盐敏感突变体ssm1的生理指标分析

探索水稻对盐胁迫的耐受机制,培育高产耐盐水稻是提高盐碱土地利用率的重要手段.通过对甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的种库进行耐盐筛选获得了盐敏感突变体ssm1,该突变体同时具有叶片早衰表型.进一步研究发现,盐处理后突变体中H_2O_2和MDA含量显著高于野生型,总抗氧化能力显著低于野生型.此外,盐胁迫处理6 h后耐盐相关基因MYB2和HKT1.1表达量下调.推测ssm1突变体的盐敏感表型是由于突变体中H_2O_2和MDA的积累导致的膜脂过氧化或膜系统受损,继而造成大量外源Na~+进入细胞导致细胞死亡.通过对盐敏感突变体ssm1的生理指标分析,探究SSM1参与水稻盐胁迫耐受机制,为培育高产耐盐水稻品种提供重要理论依据.     

水稻雄性不育突变体OsMS121的遗传及定位分析

通过射线诱变粳稻9522种子获得一株水稻雄性不育突变体OsMS121．遗传分析的结果显示突变体是单基因隐性突变．细胞学观察发现突变体花粉的萌发孔在发育过程中出现异常．萌发孔的塞子体积较小,且畸形．萌发孔的孢粉素层与野生型相比较为稀疏;环状突起不明显,结构松散,呈颗粒状．用图位克隆的方法将该基因定位在水稻第二条染色体分子标记R2M16—2和R2M18—1之间约200KB范围内．这些结果为该基因的克隆及其在花粉发育中的功能研究奠定了基础。