日本囊对虾电压门控钠通道基因克隆与组织表达

利用基因克隆等分子生物学技术,获得日本囊对虾(Marsupenaeus ja ponicus)的电压门控钠通道(voltage-gate sodium channel,VGSC)蛋白的部分eDNA序列,获得的片段核苷酸长度为2 877 bp,可编码954个氨基酸残基,总分子质量约为108.2 ku.与同源蛋白比较结果显示,日本囊对虾的VGSC序列与其他一些物种具有较高相似性,特别是跨膜蛋白结构域具有极高的保守性.基于VGSC氨基酸序列比对绘制的系统树基本能够反映出各物种间的进化关系.以RT-PCR法检测日本囊对虾VGSC的组织表达,结果显示VGSC表达与各组织的功能有极其密切的关系.VGSC mRNA在脑神经节中表达量最高,其次为肝胰腺,说明了钠通道在神经信号传导以及调节内分泌中都起到了重要的作用.     

“黄海1号”中国对虾抗白斑病的SRAP分子标记

通过SRAP(sequence related amplified polymorphism)分子标记技术,筛选中国对虾抗对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的特异性序列.以中国对虾为对象,将WSSV感病组(人工投喂感染)和抗病组,使用筛选后扩增多态性良好的52对引物对其进行SRAP,并应用生物信息学方法对结果进行分析,共找到11条特异性序列可能与中国对虾WSSV抗性相关.将特异性序列在NCBI公共数据库上进行对比发现:编号为40.3,4.20和25.14的标记序列,分别跟参与表达大西洋鲑的重金属外排蛋白和表达绵羊的免疫球蛋白以及表达斑点叉尾的醛脱氢酶基因的部分序列同源性为93%,100%,87%.标记的特异性序列参与中国对虾表达相应的功能蛋白,不但可以间接提高对WSSV的抗性,而且能作为筛选中国对虾抗WSSV的分子标记进行苗种选育.     

赤点石斑鱼LECT2基因的克隆与组织表达分析

基于LECT2的EST序列设计特异引物,采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼LECT2 cDNA全序列,全长601 bp,包括了79 bp的3′UTR区、468 bp的开放阅读框(ORF)以及54 bp的5′UTR区,共编码155个氨基酸.通过与21个物种的氨基酸序列进行同源比对发现,所推导氨基酸序列与大黄鱼的相似性最高,为78%,与其他物种的相似性在40%～73%之间,表明LECT2氨基酸序列具有较高的保守性.基于LECT2基因的氨基酸序列构建的脊椎动物系统进化树与传统物种树基本吻合.同时,通过RT-PCR方法得出,LECT2在健康赤点石斑鱼多种组织中均有表达,肝组织表达量最高,感染哈维氏弧菌(Vibrio barveyi)后LECT2在脾、头肾、鳃等免疫器官中有较高表达量,而在肝脏中表达量上调最为显著,其结果证实了LECT2与赤点石斑鱼免疫应答相关,肝脏可能是赤点石斑鱼LCET2蛋白最主要的表达场所.     

LvCTL1与WSSV复制的相互关系研究

C型凝集素(CTL)是一类重要的先天性免疫因子,在对虾机体的免疫防御中具有重要的作用.该研究利用相对定量PCR实验检测基因表达量、绝对定量PCR实验检测病毒拷贝数、组织切片分析实验检测感染病毒细胞数.实验数据显示:WSSV感染能显著上调LvCTL1的表达;WSSV感染的LvCTL1敲降的凡纳滨对虾中,膜囊蛋白VP28表达量、病毒拷贝数和胃上皮细胞中的感染细胞数都显著高于注射dsEGFP对照组.研究结果表明:WSSV感染后,机体通过上调LvCTL1表达来抑制WSSV复制.     

野桑蚕Ras 2基因的cDNA分子克隆及其特征

基于家蚕(Bombyx mori)Ras2基因的cDNA序列设计引物,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆了野桑蚕(Bombyx mandarina)Ras2基因,得到的cDNA序列长631bp,含有一个603bp的完整开放阅读框,由2个外显子和1个内含子组成,编码一个由200个氨基酸残基组成的蛋白质.该蛋白质的等电点为6.33,分子量为22.866kD.其氨基酸序列与其他昆虫Ras2氨基酸序列的同源性较高,且具有它们Ras2基因的典型特征.组织表达谱表明,该基因mRNA在野桑蚕的表皮、马氏管、中肠、脂肪体、丝腺中均有不同程度的表达.     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)ATG3基因克隆及其在WSSV感染中的表达

为了揭示凡纳滨对虾自噬相关基因LvATG3在对虾先天免疫过程中的作用,利用PCR技术克隆出LvATG3,利用荧光定量PCR方法检测LvATG3在凡纳滨对虾不同组织中的表达,用白斑综合症病毒(WSSV)侵染凡纳滨对虾,检测WSSV侵染后不同时间LvATG3的基因表达情况.LvATG3 ORF区全长948 bp,编码315...     

昆虫中肠围食膜蛋白研究进展

围食膜是大多数昆虫中肠内壁附着的一层起润滑和保护作用的半透性粘膜,按其形成方式不同分为Ⅰ型围食膜和Ⅱ型围食膜。围食膜主要由几丁质和蛋白质构成,其中蛋白质对于维持围食膜的致密结构至关重要,对围食膜蛋白的破坏可能会对昆虫的正常生长发育造成干扰,甚至会导致低龄幼虫的死亡。本文介绍了围食膜的组成与结构,阐述了昆虫围食膜蛋白研究的新发现、并依据结构特征对它们进行了分类,总结了以围食膜蛋白为新靶标的害虫防治的可能途径,讨论了当前围食膜蛋白研究的不足,最后展望了今后围食膜蛋白研究的发展方向。     

中国对虾抗菌肽成熟肽的cDNA克隆

利用RT－PCR、嵌套PCR（Nested PCR)和3’－RACE等方法，从中国对虾血细胞中克隆到1种抗菌肽基因片段，称为中国对虾肽（Chp）基因。此基因片段长543bp，开读框共有156个碱基，编码52个氨基酸。该基因所编码的氨基酸序列对应于凡那对虾抗菌肽成熟肽的序列，与其一致性为52－59％，相似性为61－73％，分子量为5652．4Da，理论等电点为9．76，带正点荷的氨基酸（Arg-Lys）为8个，不含带负电荷的氨基酸。上述这些特征（分子量较小，带正点荷）均为抗菌肽的普遍特征。     

克隆与序列分析中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）HSP70基因全长ORF的RACE

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Edocheirsinensis)的Hsp70基因并进行序列分析.以中华绒螯蟹卵组织cDNA为模板,克隆测序后拼接得到一条长2 429 bp的cDNA序列,序列分析表明其覆盖了完整编码区,编码649个氨基酸.经antheprot分析发现2个Hsp70基因的签名序列:IFDLGGGTFDVSIL,IVLVGGSTRIPKIQK;Dnak特征基序DLGTF-S-V;非细胞器基序:RARFEEL;核定位信号标签:KKDPSESKRALRRL;胞质Hsp70特征基序GPTIEEVD.经BLASTn和BLASTx软件分析,该编码区核苷酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus uannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)的相似性分别为85.30%和84.89%.根据核苷酸序列所推导出的Hsp70氨基酸序列,其与斑节对虾、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的相似性分别为93.23%和93.40%.本研究克隆了中华绒螯蟹的Hsp70基因,为进一步深入研究锯缘青蟹的抗逆机理及其遗传改良奠定了基础.     

对虾白斑综合征病毒结构蛋白基因vp95表达时序分析及其抗体的制备

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是造成养殖对虾病害的主要病原,其300kb的双链环状DNA基因组共编码532个开放阅读框(open reading frames,ORF).蛋白VP95是WSSV的结构蛋白,在病毒囊膜蛋白和核衣壳中均有分布,由ORF wsv442编码,基因全长2 400bp.首先对基因vp95的表达时序进行分析,证明该基因属于晚期基因.为了更深入地研究该结构蛋白的功能,选择中间编码200个氨基酸的片段(1 051~1 650nt)进行克隆表达.此片段被克隆到pET-His载体上,构建好的质粒转化入表达菌株大肠杆菌(Escherichia coli)BL-21(DE3),经IPTG诱导后,收集细菌,超声破碎后,将含有可溶性表达重组蛋白的上清用Ni 2+-NTA agaros纯化.纯化的重组蛋白HisVP95-M200免疫小鼠,制备抗血清.为了去除血清中的杂质,用HiTrap NHS-activated HP(GE Healthcare)亲和层析纯化柱子纯化血清中抗蛋白VP95的抗体.Western blot分析显示,未纯化的血清和纯化的抗体对病毒粒子中蛋白VP95都有很高的效价,并且具有严格的专一性.为进一步研究VP95蛋白在病毒粒子的包装中的作用,以及其在病毒的入侵过程中的功能奠定了良好的基础.     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)Hsp70基因PCR扩增及序列分析

目的：为获得凡纳滨对虾的热休克蛋白70（Hsp70）基因并分析其基因序列．方法：根据GenBank中斑节对虾（Penaeus monodon）Hsp70基因的cDNA序列,设计引物,对经高盐法提取的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）基因组DNA,采用优化的降落PCR（Touch Downeca）程序,扩增凡纳滨对虾Hsp70基因的全长序列．结果：PCR扩增得到一条长1983bp的目的DNA片段,回收纯化该片段并测定其核酸序列．用DNAman软件分析发现,该核酸序列中不含内含子,编码区全长为1959bp;经BLASTn和BLASTx软件分析发现,该编码区核苷酸序列与斑节对虾、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）的Hsp70基因序列的相似性分别为97％和62．2％．根据核苷酸序列所推导出的Hsp70氨基酸序列,其与斑节对虾、罗氏沼虾的相似性分别为99．9％和92．6％．结论：成功地从凡纳滨对虾基因组DNA中直接扩增出Hsp70基因的全长编码区序列。     

大黄鱼cyclin B1和cdc2 cDNA序列特征及组织表达分析

成熟促进因子(MPF)是诱导细胞从G2期转入M期的关键因子,在配子成熟过程中具有重要作用.MPF由周期蛋白B(cyclin B,CB)和周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK1,由cdc2基因编码)2个亚基组成.本研究克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)cyclin B1(Lc-cb1)和cdc2(Lc-cdc2)基因的cDNA序列,并分析了这2个基因mRNA的组织表达特征,为解析MPF在大黄鱼性腺发育和配子成熟的作用机理奠定基础.Lc-cb1基因全长cDNA 1 882bp,可编码397个氨基酸的蛋白;Lc-cdc2基因全长cDNA序列1 151bp,可编码303个氨基酸的蛋白.基于Lc-cb1 cDNA序列推导的氨基酸序列与6种脊椎动物的CB1氨基酸序列有较高相似性(67%~84%),并具有周期蛋白盒、毁坏盒、以及蛋白酶K位点(RRxSK)等CB预期特征.基于Lc-cdc2的cDNA序列推导的氨基酸序列也与其他6种鱼类的CDK1氨酸酸序列有较高相似性(88%~97%),并具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化结构域、ATP结合相关的保守序列(GxGxxGxV)、周期蛋白结合相关的PSTAIRE序列等CDK1的预期特征.可见,本研究克隆获得的2条序列是Lc-cb1和Lc-cdc2 cDNA全长.实时荧光定量PCR结果显示,Lc-cb1和Lc-cdc2的2个基因mRNA表达具有相似的组织特异性,在性腺中mRNA水平均远远高于其他组织,表明Lc-cb1和Lc-cdc2是大黄鱼性腺发育相关的重要基因.     

日本囊对虾Na-K-2Cl共同转运蛋白基因的克隆与组织表达分析

利用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)等技术在鳃组织中获得日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)Na-K-2Cl共同转运蛋白(NKCC)cDNA全序列,包含14bp的5′非编码区(5′-UTR)、201bp的3′-UTR和3 183bp的开放阅读框(ORF).该ORF共编码1 060个氨基酸,预测蛋白分子质量为117.051ku,理论等电点为6.57,命名为Mj-NKCC.预测Mj-NKCC二级结构由10个跨膜区组成,跨膜区的氨基酸序列和布局均相对保守.同源对比结果显示,Mj-NKCC的氨基酸序列与夏威夷海蚀洞虾(Halocaridina rubra)的Na-K-2Cl共同转运蛋白相似度最高,为77%.系统进化分析表明Mj-NKCC与夏威夷海蚀洞虾、蓝蟹(Callinectes sapidus)等甲壳动物的NKCC聚为一支.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,Mj-NKCC基因在肝胰腺、鳃、胃、肠、心、眼柄、肌肉和血细胞中均有表达,鳃组织中表达量最高;在盐度骤变时,该基因表达变化显著,表明其很可能参与了对虾的渗透压调节,在对虾的渗透平衡中发挥重要作用.     

对虾白斑病毒多抗原决定簇重组蛋白的抗原性分析

为研究重组多表位蛋白制备疫苗的方法的可行性,研究通过利用目前有研究证实与对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染与致病力相关的重要决定因子囊膜蛋白VP28、VP19和被膜蛋白VP26,从这三种蛋白基因中筛选表位基因,将这些筛选到的抗原表位通过最优化的方式组合以及密码子优化,组成新的表位基因序列,命名为Y1798G,长度为509 bp。将该基因克隆到p ET-32a原核表达载体,生产抗原表位蛋白。将纯化的抗原蛋白注射到小白鼠体内,获得抗体;并通过蛋白免疫印迹(western blot)实验验证获得的抗体能否识别结合WSSV。结果表明所构建的抗原表位重组蛋白对WSSV具有特异抗原性,可见此种制备对虾白斑病毒疫苗的策略具有可行性。     

野桑蚕漆酶基因克隆、序列分析及转录表达谱研究

利用RT-PCR方法,克隆了野桑蚕Bombyx mandarina漆酶基因,获得了其cDNA序列.该序列长2 317bp,含有一个2 295bp的完整开放阅读框,有8个外显子,7个内含子,编码一个由764个氨基酸残基组成的蛋白质,其蛋白质的分子量和等电点分别为84 340.91和6.61.推导的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫(Laccase)基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的漆酶基因所共有的典型特征.组织特异性表达分析表明了该基因仅在野桑蚕的表皮、头部、中肠和血液中有表达.这些结果为进一步研究野桑蚕漆酶基因的功能提供了分子基础.     

刀额新对虾周期蛋白B基因的分子克隆及序列分析

周期蛋白B(cyclin B)是真核生物细胞周期的一种重要调控原件,通过调节周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclindependent kinase,CKD)的活性可以控制细胞周期.运用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆了刀额新对虾(Metapendeusensis)cyclin B基因.刀额新对虾cyclin B的cDNA全长为1681 bp,5′端非编码区为111 bp,3 ′端非编码区为355 bp,开放阅读框为1215 bp,编码404个氨基酸,平均分子质量为45767.9 u,pl为8.81.Blast比对后发现,其氧摹酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)的同源性达约90％.基于cyclin B序列所绘制的进化树基本上能反映出各物种间的进化关系.半定量RT-PCR结果显示,刀额新对虾的cyclinB基因在不同组织表达中具有明显的组织特异性,在鳃、卵巢和心脏中有较高的表达量,在眼柄神经节和胸神经节中表达量较低.推测该差异性主要与cyclin B在细胞周期中调控细胞分裂的功能有关.     

家猪信号转导及转录激活因子基因3、5a及5b的克隆、剪切变体鉴定及组织表达图谱分析

本研究以家猪为材料,克隆了家猪STAT3、STAT5a、STAT5b基因的cDNA全长,序列分析显示:家猪STAT3基因cDNA编码770个氨基酸的蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠STAT3氨基酸序列一致性高达99%;STAT5a基因cDNA编码799个氨基酸的蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠氨基酸序列一致性分别为分别为96%,97%,95%,和95%;STAT5b基因cDNA编码787个氨基酸的蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠氨基酸序列一致性高达98%.同时,还鉴定到STAT3的一种新剪接变体以及STAT5a的三种剪接变体.采用RT-PCR方法,我们进一步检测了这些基因mRNA在成年家猪各组织中的表达情况.STAT3在除了心脏和肌肉以外的其他被检测组织中均有较高的表达水平;STAT5a在肝脏、肾脏、脾脏、肺和卵巢中有较高的表达水平;STAT5b在所有被检测的组织中均有表达.     

中国明对虾卵黄蛋白原部分cDNA序列和表达部位研究

从成熟的中国明对虾卵巢中提取总RNA,经同源克隆得到了卵黄蛋白原(Vg)部分cDNA序列,长度为1 226 bp。在NCBI上比对后发现它与墨吉明对虾、短沟对虾等的Vg mRNA序列有很高的相似性。根据8种虾(墨吉明对虾、短沟对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾、刀额新对虾、罗氏沼虾、高背长额虾和中国明对虾)Vg mRNA相应序列建立了系统发生树。通过RT-PCR证实了雌虾的卵巢和肝胰腺是卵黄蛋白原的合成位点。     

中国鲎β-actin基因的克隆与组织表达

中国鲎(Tachypleus tridentatus)是一种古老的海洋动物.利用RT-PCR和RACE等分子生物学技术,获得中国鲎β-肌动蛋白基因(中国鲎β-actin,简称为TTBA)全长cDNA序列,总共1 515bp,包括70bp 5′非编码区(untranslated regions,UTR)、314bp 3′UTR和一个1 131bp的开放阅读框(open reading frame,ORF).ORF可编码376个氨基酸残基,总分子质量约为41 807.7u.同源蛋白的序列比较结果显示,TTBA推导氨基酸序列与其他物种具有很高的相似性,推测β-actin基因具有很高的遗传保守性.而基于β-actin蛋白序列比对而绘制的系统进化树显示中国鲎与其他节肢动物具有较高的相似性,此结果与其现行的分类地位基本一致.以Real-time RT-PCR法检测表明,在卵子发生各期的卵巢组织中TTBA表达量保持稳定(p>0.05),可作为定量检测的内参基因.     

家猪BMP-2、BMP-3基因克隆及其组织表达探究

本研究以长白猪(Landrace)肺cDNA为模板,扩增获得猪骨形态发生蛋白BMP-2和BMP-3基因的cDNA全长.BMP-2基因cDNA全长为1742bp,编码395个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-2基因的氨基酸序列一致性分别94.18%,95.4%,95.2%,90.3%,90.60%;BMP-3基因cDNA全长为1639bp,编码475个氨基酸的前体蛋白,猪与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-3氨基酸序列的一致性分别是84.7%、87.7%、82.3%、80.4%、79.5%.采用RT-PCR方法,对BMP-2、3基因在家猪主要组织的表达进行探究.结果显示:BMP-2在所有组织中均有表达;而BMP-3在脑、肺、小肠中表达量较高,其他组织中表达量弱.