双抗体夹心ELISA检测禽流感病毒方法的初步建立

用饱和硫酸铵初步纯化的兔抗AIV-H9高免血清中的IgG作为包被抗体,利用抗AIV-NP-7B4单抗作为ELISA的第二抗体,建立了检测禽流感病毒(AIV)抗原的双抗体夹心ELISA方法. 经方阵滴定试验测定反应的最佳工作条件为:兔抗AIV-H9高免血清IgG包被稀释度为1: 8 000(浓度为3.531 ug/mL),抗AIV-NP-7B4单抗腹水最佳使用稀释度为1: 800,酶标二抗的工作浓度为1: 4 000. 与其他禽易感病毒(NDV、IBV、EDS-76V)等均没有交叉反应. 结果表明,本方法具有很高的特异性.     

BK病毒样颗粒制备及血清学检测方法的建立

将BK病毒 ( BK polyomavirus, BKV )的结构蛋白VP1 通过重组杆状病毒在昆虫细胞中表达, 并自发装配成BKV病毒样颗粒(BK virus like particles, BK VLPs). 以BK VLPs作为包被抗原建立了间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)的血清学检测方法: 抗原最佳包被浓度为3.1 μg/mL, 血清最佳稀释度为1∶200, 酶标抗体最佳工作稀释度为1∶40000.并以该方法在国内对540名健康成年人进行BKV抗体阳性率情况调查, 结果显示我国健康成年人BKV抗体阳性率为79.94%.     

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能够引起牛羊的持续感染,临床上很难对其根除,建立该病有效检测方法对净化畜群具有重要意义。本研究构建BVDV E0蛋白基因重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达,用重组的E0蛋白为包被抗原,确定抗原最佳包被浓度为5μg/mL,最佳血清稀释比为1∶10,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,最佳封闭条件为37℃封闭2 h,酶标二抗稀释度为1∶5000,作用时间为30 min,样品临界值X+2S为0.278。该方法与IDEXX的BVDV间接ELISA试剂盒比较总符合率为86%,与口蹄疫病毒、牛支原体、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副结核、牛布鲁氏菌病阳性血清无交叉反应。该检测方法能够用于BVDV抗体水平的临床检测,可为感染病畜的合理淘汰提供实验依据。     

不同小鼠肝炎病毒对ELISA方法检测其血清抗体的影响

目的 建立小鼠肝炎病毒（Mouse Hepatitis Virus,MHV）血清抗体ELISA检测方法,用于本地区MHV的日常监测,以便对SPF小鼠感染状况及时作出判断。方法 选取3种MHV毒株MHV1、MHV-JHM和MHV-A59,通过L929细胞扩增培养获得纯化浓缩抗原并筛选适合包被抗原类型;免疫BALB/C小鼠,获得高效价免疫阳性血清;优化ELISA反应体系建立规范化的ELISA试剂盒并用于临床小鼠血清样品的检测。结果 筛选出适合本地区的MHV包被抗原类型为MHV1,建立了病毒扩增及浓缩纯化方法,制备的MHV抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为标准化质控血清。包被抗原、待检血清和酶结合物最佳工作浓度分别为4. 0μg/m L (10 -7. 73 /0. 1 m L TCID50)、1∶40和1∶4 000稀释;批次内和批次间平均变异系数分别为5. 13%和5. 57%;检测灵敏度为1∶4 000稀释;与小鼠仙台病毒（SV）、小鼠肺炎病毒（PVM）、呼肠孤病毒III型（Reo3）、小鼠细小病毒（MVM）和鼠痘病毒（Ect）阳性血清均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于10%。对165份血清样品进行检测,阳性血清相符率97. 37%（37/38）,阴性血清相符率92. 19%（118/127）。结论 本研究建立的ELISA方法检测小鼠血清MHV抗体具有较高的特异性、敏感性和结果可重复性,可以用于本地区MHV日常病原学监测,以便对小鼠感染状况作出准确判断。     

猫疱疹病毒Ⅰ型( FHV-1) 抗体 ELISA 检测方法的建立与初步应用

摘要: 目的 建立猫疱疹病毒Ⅰ型( FHV-1) 抗体 ELISA 检测方法,应用于临床样品中 FHV-1 抗体的检测。方法 培养猫肾传代细胞( CRFK) ,接种 FHV-1 病毒,制备 CRFK 正常抗原和 FHV-1 特异抗原,滴定山羊抗猫 IgG-HRP 和 抗原最佳工作浓度,并进行特异性、敏感性、稳定性及精密性实验。结果 正常抗原、特异抗原和酶结合物最佳工 作浓度分别为 0. 05 μg /mL、10 μg /mL 和 1∶ 5 000; 正常抗原、特异抗原批内变异系数分别为 8. 7% 和 5. 8% ,批间平均变异系数分别为 11. 9% 和 6. 6% ; 检测灵敏度为 1∶ 6 400; 与猫细小病毒( FPV) 、猫杯状病毒( FCV) 均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于 25% 。结论 建立的 ELISA 方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强,可用于猫 FHV-1 抗体的检测。     

夹心ELISA检测新冠病毒及其抗原方法的建立和验证

研究制备了快速检测新冠病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）及其表面刺突糖蛋白受体结合域（receptor-binding domain,RBD）的ELISA试剂盒.该试剂盒由一对RBD单克隆抗体作为捕获抗体与检测抗体，其中检测抗体进行辣根过氧化物酶（HRP）偶联，通过方阵滴定法确定双抗夹心ELISA的最适工作条件.另外，对检测试剂盒进行线性、特异性、准确度、精密度等进行了验证.结果表明，双抗夹心ELISA方法中捕获抗体和酶标检测抗体的效价分别为1∶160 000和1∶320 000，试剂盒的定量检测下限为31 ng/mL.经验证，组装的试剂盒精密度为0.71%～1.59%，平均准确度为96.53%，与其他的同种属灭活病毒无交叉反应.试剂盒各项参数均符合《中国药典》（三部）2020版标准，表明该试剂盒适用于新冠病毒以及RBD抗原的快速检测.     

长爪沙鼠仙台病毒( SeV) 抗体ELISA 检测方法的建立与应用

摘要: 目的建立长爪沙鼠仙台病毒( SeV) 抗体ELISA 检测方法,用于长爪沙鼠体内仙台病毒抗体的检测。方法孵育鸡胚,接种SeV,制备鸡胚尿囊液正常抗原和SeV 特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行特异性、敏感性、精密性、稳定性实验。结果正常抗原、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0. 1 μg /mL、2 μg /mL 和1∶ 5 000; 正常抗原、特异抗原批内变异系数分别为9. 6% 和8. 4%,批间平均变异系数分别为9. 0% 和5. 9%; 检测灵敏度为1∶ 10 240; 与沙鼠小鼠肝炎病毒( MHV) 、小鼠肺炎( PVM) 、呼肠孤病毒3 型( Reo3) 均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA 方法特异性、敏感性强,重复性、稳定性好,检测结果,准确、可靠。可用于长爪沙鼠体内SeV 抗体的检测。     

抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备研究

从影响融合率的2个主要因素探讨骨髓瘤细胞系Sp2/0细胞与黄曲霉毒素B_1免疫的脾细胞融合的最佳条件,使融合率达到100%.经筛选和克隆化,获得3株稳定分泌单克隆抗体的细胞株,分别命名为3B3、3H9、5G9.经过鉴定3株均为IgG_1亚类.其中3B3抗体与其他黄曲霉毒素几乎不发生交叉反应,腹水效价为1∶2×10~5,亲和力常数为3.1×10~7 L/mol,竞争性ELISA测出3B3抗体的最低反应浓度为0.05μg/L标准AFB_1样品的的回收率达96%.另外两株腹水抗体水平低,交叉反应强烈,腹水效价仅在1∶10~4数量级.     

应用流式微球检测黄曲霉毒素B1方法的建立

采用活性酯法,将AFB1-BSA人工抗原交联于含有羧基表面的荧光微球,通过与游离AFB1竞争抗AFB1单克隆抗体后,再与异硫氰酸荧光素标记二抗的反应,建立基于微球的间接竞争免疫检测方法.检测结果表明,流式细胞仪检测AFB1的检测限为0.03 ng·mL-1,检测范围为0.05～1.0 ng·mL-1.与黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2的交叉反应率均低于1.0%.在玉米样品中的加标回收率为87%～103%,变异系数为6.1%～8.4%.     

化学发光-酶联免疫高灵敏检测洛美沙星

建立了洛美沙星的化学发光-酶联免疫分析方法。实验对包被抗原的度盘浓度、洛美沙星抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗的稀释倍数、酶标板的种类等进行了优化。在最佳实验条件下,测得的IC₅₀值为0.22ng／mL, 检测限为0.032ng／mL。该方法具有良好的特异性,在检测的10种代表性的喹诺酮类药物中,仅诺氟沙星和氟罗沙星交叉率高于1％(分别为:6.88％和2.16％)。将该方法应用于脱脂牛奶中添加洛美沙星回收率的测定,批内和批间回收率分别为:88.7％～103.4％和97.8％～107.2％,相应变异系数分别为:6.3％～8.6％和2.4％～8.0％。     

油脂中黄曲霉毒素B_1快速检测试剂盒研究

在胶体金免疫层析技术的基础上,建立了一种快速检测油脂中黄曲霉毒素B1(AFB1)的新方法.本研究的AFB1快速检测试剂盒突破了常规胶体金免疫层析检测试纸只能检测水溶液样品的限制,可对含油脂样品直接检测,工作时无需复杂的油脂样品处理工艺,缩短了预处理时间.其基本原理是利用吐温(Tween 20)对油脂样品进行乳化处理,使油脂在油脂处理液(甲醇-吐温-磷酸缓冲溶液)中均匀分散为微小油滴,形成稳定的水包油型乳化体系,从而使水相中的抗原、抗体反应不受油脂干扰.测试结果表明本试剂盒对油脂中的AFB1的检测限为10ng.mL-1,检测时间为10min,无假阳性、假阴性.     

黄曲霉毒素B1(AFB1)降解菌的筛选鉴定

以香豆素为唯一碳源和能源的培养基进行初筛,然后将菌株与黄曲霉毒素B1(AFB1)共培养后测定AFB1降解率的方法进行复筛,最后筛选出4株高活性AFB,降解菌;其中G3-21和T1-4-1对AFB1降解率可达到65％,Y2-30和T1-3-7对AFB1的降解率达到45％以上,形态和16S rDNA序列分析鉴定结果表明,G...     

改进双抗夹心ELISA用于筛选单抗杂交瘤细胞株

本文利用改进双抗夹心ELISA筛选一种可测定血清样品中与血浆蛋白结合的蛋白质药物的单抗。用兔抗K102多抗经亲和层析纯化并包被后,加入用10%猴血浆PBS还原后的抗原K102,再加入杂交瘤细胞株上清液和HRP-羊抗鼠IgG、底物反应液筛选阳性单抗杂交瘤细胞株。结果用改进后的双抗夹心ELISA筛成功地选出6株能稳定分泌针对K102的单抗杂交瘤细胞株,分别命名为1C9、2D7、3E2、5F4、5F6、6B9;细胞株产生的单抗用ELISA法能检测出血清样品中的K102的浓度。提示改进的双抗夹心ELISA可用于针对与血浆蛋白结合的蛋白质药物的单抗杂交瘤细胞株的筛选。     

抗人骨桥蛋白单克隆抗体制备及其特异性研究

利用RT-PCR技术克隆人骨桥蛋白(hOPN)基因,构建OPN原核表达质粒pET-32a(+)-hOPN,转化BL21菌株,经IPTG诱导表达重组人骨桥蛋白(rhOPN).以纯化的rhOPN为免疫原,免疫BABL/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS1融合.通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得抗人OPN蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,以ELISA、Western blot对抗体特异性进行鉴定.通过竞争抑制试验对单克隆抗体识别抗原位点进行分析.结果共获得2株抗人OPN单克隆抗体,分别命名为8F1和2B5,亚型测定皆为IgG1.通过细胞侵袭抑制试验检测,2株抗人OPN mAb皆能很好地抑制细胞迁移.本研究成功获得了抗人骨桥蛋白的特异性单克隆抗体,为进一步研究OPN蛋白在自身免疫病和肿瘤中的功能提供了重要的工具.     

氟苯尼考残留的酶联免疫检测方法的研究

对氟苯尼考进行结构改造制备半抗原及抗原,免疫家兔得到多克隆抗体。经测定,该抗体对氟苯尼考和氟苯尼考胺均有反应,且灵敏度较高,效价达到1∶480 000;在此基础上通过对各实验条件参数的优化建立了间接竞争酶联免疫检测方法,该方法检测限为0.5μg/kg,以20,50μg/kg进行空白样品添加实验,回收率为82.5%～96.0%,批间变异系数在4.1%～15.2%,可初步用于动物组织样本中氟苯尼考残留的检测.     

血清抗Sm抗体ELISA检测方法的建立

目的：建立血清抗Sm抗体的ELISA检测方法。方法：应用纯化的Sm抗原,采用棋盘滴定等方法确立ELISA方法检测血清抗Sm抗体的最适实验条件。结果：建立了血清抗Sm抗体的ELISA检测方法。SLE患者血清抗Sm抗体的阳性率为29．2％,正常人和其它自身免疫病患者未查到此抗体。结论：本文建立的血清抗Sm抗体检测方法敏感性达到国外进口试剂盒的水平,且操作简便,重复性好,因此临床很有实用价值。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因原核表达产物的检测应用

利用猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的原核表达产物,分别建立了检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的间接ELISA方法及乳胶凝集试验．对200份血清样品分别应用建立的间接ELISA方法和乳胶凝集试验,及由IDEXX公司生产的EUSA检测试剂盒进行抗体检测,结果显示,乳胶凝集试验及间接ELISA方法与IDEXX公司试剂盒相比,检出符合率分别达78％和91％．建立的乳胶凝集试验还需改进,而N蛋白-ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,是一种有应用前景的检测方法．     

黄曲霉毒素高污染区肝细胞癌P53基因高频率定点突变

用聚合酶链反应及限制性片段长度多态性（ＰＣＲ＿ＲＦＬＰ）分析技术，对广西黄曲霉毒素高污染２例肝细胞癌（ＨＣＣ）进行分析，检查Ｐ５３基因第７外显子的２４９密码子的突变频率。结果发现３６／５２例ＨＣＣ中２４８密码子有集中的点突变，频率为６９．２％。Ｐ５３基因突变热点与乙型肝炎病毒感染无关。提示黄曲霉毒素Ｂ１是突变热点的主要原因。