芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

库拉索芦荟叶皮经匀浆、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液抽提,硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose fast flow层析和Superdex-200prep grade层析,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,BGL).纯化结果是β-葡萄糖苷酶比活力为98.48U/mg,纯化倍数为328.27倍,酶活性回收率为9.87%,全酶分子质量约为69.3kD,亚基分子质量约为69.7kD.酶学性质研究表明:β-葡萄糖苷酶的最适反应温度和最适反应pH值分别为40℃和5.0;在20~30℃及pH4.0~8.0范围内稳定性较好;最适条件下,以pNPG为底物的K_m值为2.21mmol/L,V_(max)为1.381μmol/(min·L).乙醇,抗坏血酸,Mn~(2+),K~+对该酶活性具有激活作用;SDS,Cu~(2+)对该酶活性具有强烈抑制作用;异丙醇,EDTA,尿素,Mg~(2+),Li+对该酶活性影响较小;甲醇对该酶有双重作用.     

β-葡萄糖苷酶体外分子改造研究进展

β-葡萄糖苷酶是纤维素酶的重要成分之一,负责纤维素的最终降解,在畜牧生产、食品行业、能源和医疗卫生等领域都有重要应用.天然来源的β-葡萄糖苷酶表达水平低、分离纯化困难,阻碍了β-葡萄糖苷酶的进一步应用.利用蛋白质工程技术对β-葡萄糖苷酶进行体外改造,提高其糖苷水解或者低聚糖苷合成活性,是β-葡萄糖苷酶研究及应用的趋势.就β-葡萄糖苷酶体外分子改造的研究进展及成果进行综述,比较不同分子改造策略的特点,总结β-葡萄糖苷酶分子改造过程中的一般规律,展望β-葡萄糖苷酶分子改造的研究及发展方向,为微生物来源的β-葡萄糖苷酶的体外分子改造研究提供参考.     

海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶的制备及其性质研究

在活性炭、明胶等8种固定化载体筛选的基础上研究了以海藻酸钠为载体,戊二醛为交联剂固定化β-葡萄糖苷酶的条件,并对固定化酶的酶学性质及其在催化制备大豆异黄酮活性苷元染料木素中的应用进行了研究。β-葡萄糖苷酶在0.20%戊二醛溶液中交联2 h后再与20 g/L海藻酸钠混合,然后逐滴加到4 g/LCaCl2溶液中,固化1 h后过滤、洗涤得固定化β-葡萄糖苷酶,固定化酶的酶活回收率为83.67%。固定化酶的最适温度、热稳定性、pH值稳定性以及与底物的亲和力都有所提高,最适pH值基本不变。该固定化酶重复使用6次后其活力仍保持90.94%,染料木苷转化率达60.02%。     

地衣芽胞杆菌产纤溶酶的分离、纯化及其酶学性质研究

以地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WBL-3进行固体发酵生产纤溶酶.通过生理盐水浸提、离心去除菌体、硫酸铵分级盐析、透析、离子交换层析和凝胶过滤层析对酶进行分离纯化,SDS-PAGE电泳检测酶的分子量大小,并对该纤溶酶的酶学性质进行研究.结果表明:经凝胶过滤层析后,纯化倍数为33.19,回收率12.39％;SDS-PAGE电泳检测为单一蛋白条带;酶学性质分析表明:酶的最适反应温度为55℃,稳定性随着温度的升高而降低;最适反应pH为8.5,pH7-10范围内酶活稳定性较高;Mg2+对该酶有微弱的激活作用,Cu2+、Ag+、Fe3+、Hg2+、Pb2+对酶有较强的抑制作用.本研究为开发新的溶栓药物提供了新的选择.     

固定化β-葡萄糖苷酶的酶学性质

以壳聚糖微球为载体构建了固定化β-葡萄糖苷酶,研究了固定化和游离β-葡萄糖苷酶的酶学性质.结果表明:固定化和游离β-葡萄糖苷酶的最适pH均为4.5;固定化β-葡萄糖苷酶的最适温度为60℃,比游离酶低5℃;固定化β-葡萄糖苷酶的pH稳定性和贮存稳定性明显高于游离酶,但热稳定性略低于游离酶;固定化和游离β-葡萄糖苷酶的表观米氏常数和米氏常数分别为0.52 mmol/L和2.4 mmol/L;固定化β-葡萄糖苷酶重复分批酶解10 g/L的纤维二糖,其操作半衰期为31 d左右.     

栀子苷的提取及酶促水解生产京尼平的研究

栀子苷是栀子果实中的主要生物活性物质之一.本研究用乙醇浸提栀子果实获得栀子苷浸取液,使用AB-8大孔吸附树脂对栀子苷进行纯化,栀子苷的收率为1.79％.用固定化β-葡萄糖苷酶对纯化后的栀子苷进行酶促水解,获得富含京尼平的栀子苷酶促水解液,经TLC和HPLC分析结果表明:酶法水解12 h后可得到含大量京尼平的水解液.     

重组粘质沙雷氏菌几丁质酶C的纯化及酶学性质

为从已构建的重组大肠杆菌pET-22b-chiC获得高纯的几丁质酶C,通过降低培养温度,提高粘质沙雷氏菌几丁质酶C的可溶性表达.表达产物经镍柱亲和层析(IMAC)和Phenyl-Sepharose疏水层析(HIC)分离纯化后,得到电泳纯的几丁质酶.酶学性质研究表明,纯化的几丁质酶C为单体蛋白,相对分子质量为51.8ku;最适pH值为5.0,最适温度为55℃,在55℃的条件下保温4 h后仍有90%以上的酶活力.研究结果还表明,Cu2+,Hg2+,Co2+,Mg2+对酶活力均有明显抑制作用,而Fe2+,Zn2+,Sn2+,Ba2+对酶活力有一定促进作用,Mn2+对酶活力明显促进作用.     

宏基因组来源β-半乳糖苷酶的异源表达与酶学性质研究

β-半乳糖苷酶在食品行业具有重要应用价值,开发兼具多种优良特性的β-半乳糖苷酶是目前研究的重点.本研究对胃肠道微生物宏基因组来源的β-半乳糖苷酶基因galRBM1进行异源表达、纯化及酶学性质研究,结果表明,重组β-半乳糖苷酶的最适pH为7.0,最适温度为50℃,30~50℃耐受4h仍保持85%以上剩余酶活;pH稳定性较好,pH5~10范围内耐受1h仍保持80%以上的相对酶活.Fe~(2+)和Fe~(3+)对该酶酶活有强烈促进作用,Cu~(2+)、Ag~+和Tween-80则表现出不同程度的抑制.该酶耐盐性较好,0~30%NaCl条件下耐受1h相对酶活仍剩余40%以上.     

Paenibacillus sp.K1 α-半乳糖苷酶酶学性质

利用CODEHOP PCR和Anchor-ligated PCR方法从类芽孢杆菌Paenibacillus sp.K1中克隆得到一个α-半乳糖苷酶基因aga P1,大小为2 190 bp,同源性分析显示,该基因与其他α-半乳糖苷酶基因的序列相似低,是一个新的α-半乳糖苷酶基因。将aga P1在大肠杆菌Origami B(DE3)中表达并纯化获得Aga P1,酶学性质分析显示:以p NPG为底物时,Aga P1最适反应温度为40℃,最适p H 6.5~10,Km值为0.75 mmol/L,最大反应速率Vmax为1.96μmol·min-1·mg-1。同时Fe2+、Mg2+、Ca2+、K+和甘油能使α-半乳糖苷酶酶活提高1~3倍,而Cu2+、Zn2+、Fe3+和还原型谷胱甘肽则抑制该酶的活性。SDS-PAGE检测Aga P1蛋白大小约为80 ku,与理论预测值基本一致;Native-PAGE分析表明正常条件下Aga P1蛋白以二聚体或六聚体形式存在。以上结果显示,Paenibacillus sp.K1产生的α-半乳糖苷酶为一个新的低温α-半乳糖苷酶。     

芽孢杆菌（Bacillus subtilis No.16A）苎麻脱胶聚半乳糖醛酸裂解酶的纯化及酶学性质

通过丙酮沉淀,阳离子交换层析,凝胶过滤,从苎麻脱胶菌Bacillus subtilis No.16A发酵液中纯化了聚半乳糖醛酸酶（PGase）.结果表明该酶分子量为30.2?ｋu,最适作用pH为9.0,最适作用温度为50?℃,在55?℃以下、中性pH（6.0～8.0）范围内稳定, Ca2+、Mg2+对该酶有激活作用, Cu2+、Mn2+、Co2+、Hg2+有抑制作用,酶解产物在235 nm处有强吸收峰,说明该酶是聚半乳糖醛酸裂解酶.     

里氏木霉纤维素酶系的分离及其酶学性质

采用两级超滤、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、CM-Sepharose FF阳离子交换层析和Sephadex G-100凝胶渗透层析等分级纯化步骤,从里氏木霉纤维素酶系中分离纯化得到电泳纯的3个内切葡聚糖酶组分EGⅠ、EGⅡ和EGⅢ,2个外切葡聚糖酶组分CBHⅠ和CBHⅡ和1个β-葡萄糖苷酶组分,它们对各自底物的比活力分别为176.35、153.96、64.22、16.86、4.82、31.00 IU/mg,米氏常数分别为6.70、8.46、13.22、1.37、3.46、2.20 mg/mL.同一类酶组分的米氏常数Km越大,转换数Kcat越小.分离纯化所得EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ、CBHⅠ、CBHⅡ和GB等酶组分的分子量分别为50、46、25、65、58、75 kDa.     

瑞氏木霉β-内切葡聚糖酶的纯化及其部分酶学性质研究

 利用盐析、SephadexG-75和DEAE-SephadexA50层析,从瑞氏木霉TrichodermareeseiQM9414发酵液中纯化了2个具有β-内切葡聚糖酶活性的组分Eg1和Eg2,分子质量分别为65.47ku和57.04ku.其最适温度分别为50℃和55℃,最适pH分别为4.8和5.0,米氏常数Km分别为3.76×10^-2g/L和4.20×10^-2g/L.根据其酶学性质,这是一类不同于已有的β-内切葡聚糖酶,为瑞氏木霉T.reeseiQM9414所产β-内切葡聚糖酶的进一步研究奠定了基础.     

粘质沙雷氏菌脂肪酶的分离纯化

粘质沙雷氏菌L-42发酵液经离心、丙酮沉淀、离子交换层析以及凝胶过滤等步骤,获得了比活性为1166.61 U/mg 的碱性脂肪酶,提取得率为20%,纯化倍数45.57倍,在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上均呈现单一蛋白质条带,显示该酶为单体,SDS-PAGE测得酶的相对分子量约为 50 kDa.酶学特性研究结果表明,该酶的最适反应温度为35 ℃,最适pH值为9.0,在50 ℃以下、pH6.0~10.0范围内保持较好的稳定性. Ca2+、Mg2+ K+、Mn2+、Ni+等对酶有激活作用,而Fe2+、Zn2+、Co2+等对酶活有抑制作用.     

黑色葡萄状穗霉纤维素酶的纯化和性质

将筛选所得的黑色葡萄状穗霉（Stachybotrys atra)S607发酵培养96h，发酵液离心去除菌体，上清液经超滤、Sephadex-G100柱层析、DEAE－Sepharose fast flow弱阴离子交换层析、CM－Sepharose fast flow阳离子交换层析、Q－Sepharose fast flow强阴离子交换层析及置换层析等步骤，得到了4种电脉纯的酶组分，即内切纤维素酶EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ和β葡萄糖苷酶（βGase）。利用SDS－PAGE测得4种酶组分的分子量分别是78.3、58.1、72.4和55.6kDa。3种内切酶组分的最适温度都是50℃，β葡萄糖苷酶为55℃，它们的最适pH值分别是6.0、7.0、6.5和6.0。底物专一性的实验表明，内切酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都可作用于木聚糖。     

黑曲霉胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究

利用硫酸铵盐析、Superdex 200凝胶柱层析等步骤,从黑曲霉发酵液中纯化得到两种β–葡萄糖苷酶蛋白,其相对分子质量分别为1.15×105和7.0×104左右,比活力分别为62.1,U/mg(相对分子质量约为1.15×105)和53.0,U/mg(相对分子质量约为7.0×104),纯化倍数分别为1.54和1.31,回收率分别为19.6%,和19.1%,β–葡萄糖苷酶最适水解p H为4.6,最适反应温度为50~55,℃.在p H 4.2~4.8、温度40~60,℃下均能保持稳定.Mn2+、Mg2+和K+对β–葡萄糖苷酶有不同程度的激活作用,而Ca2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+和Fe2+会抑制β–葡萄糖苷酶的酶活,Na+和Ba2+对β–葡萄糖苷酶活力影响不明显.以p NPG为底物时,该酶的Km和vmax分别为2.33,mmol/L与3.14,mmol/(L·min).     

腐牛乳中产β-半乳糖苷酶酵母菌菌株的分离和筛选以及该酶的提纯与固定化

从腐牛乳中分离筛选出一产β-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23)酵母菌菌株(No.47).摇瓶发酵获酵母细胞,利用甲笨-自溶法破碎细胞,抽提的β-半乳糖苷酶通过2次丙酮沉淀,DEAE-纤维素(DE52)柱层析、羟基磷灰石柱层析进行纯化。该酶仅以一种分子形式存在。巯基与酶的活性中心有关。此酶对金属离子敏感,能被多种金属离子及SDS、Urea、EDTA等抑制。纯化的酶固定在戊二醛交联的明胶颗粒上,残活力为14%。固定化酶最适pH为6.6,而自然酶最适pH为6.4;固定化酶与自然酶最适温度均为45℃;固定化酶pH稳定范围为6.8-9.2,自然酶为6.4-9.2,自然酶为6.4—8.0;固定化酶热稳定性优于自然酶;以邻硝基苯酚-β-D-吡喃型半乳糖苷(简称ONPG)为底物,固定化酶表观米氏常数为3.4mmol·dm~(-3),自然酶米氏常数为2.5mmol·dm~(-3)。     

灰绿曲霉产纤维素酶的研究

灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)发酵液通过硫酸铵盐析、Sephadex G-100分子筛、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱和Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析,分离纯化一种外切葡聚糖酶(CBH)和一种内切葡聚糖酶(EG).通过SDS-PAGE和凝胶柱层析法测定分子质量表明:CBH全酶分子质量为71 ku,由两个分子质量为35 ku的同型亚基组成;EG为单体蛋白,全酶分子质量为32 ku.酶学性质研究表明:CBH催化pNPC的最适pH为6.0,最适温度为55 ℃,酶活在pH 5.0～8.0 区间和温度低于55 ℃时稳定;EG催化CMC-Na的最适pH为4.0,最适温度为50 ℃,酶活在pH 3.5～7.5区间和温度低于65 ℃时稳定.Na+、K+、Ba2+、Mg2+以及NO-3和SO2-4对CBH和EG酶活均无影响;Ca2+和Mn2+对CBH有激活作用,Fe2+和Mn2+对EG有激活作用,而Zn2+、Cd2+和Cu2+对CBH和EG均有不同程度的抑制效应.酶动力学分析表明:CBH催化pNPC水解的米氏常数Km值为1.4 mmol/L(pH 6.0,55 ℃),EG催化CMC-Na水解的米氏常数Km值为5.0 mg/mL(pH 4.0,50 ℃).     

不同β-葡萄糖苷酶性能分析及对罗汉果苷的转化

以Pichia pastoris GS115为宿主,对来源于特异腐质霉Humicolainsolens、棘孢曲霉Aspergillus aculeatus和黑曲霉Aspergillus niger的β-葡萄糖苷酶基因bglHi、bglAa和bglAn进行异源表达。以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物,分析了3种酶的酶学性质,其中BglAn的酶活力最高,为90.83U/mg。3种酶的最适反应温度和最适pH值范围分别为55~65℃和5.0~6.0。在pH值为6.0、温度50℃、酶量2U的条件下,利用3种酶水解不同浓度的罗汉果苷Ⅴ。结果表明:不同来源的酶水解底物的特异性差别较大,其中BglHi和BglAa水解罗汉果苷Ⅴ生成罗汉果苷ⅢE的转化率较低,仅为5%~7%;而BglAn在底物质量浓度1mg/mL,反应20min时转化率为96.5%;提高底物质量浓度到5mg/mL,反应1h时转化率也可达97.9%,基本实现完全转化。通过酶法转化罗汉果苷Ⅴ,获得了较高纯度的产物罗汉果苷ⅢE,为后期开发不同结构、不同功能罗汉果苷类甜剂提供了新的途径。     

繁茂膜海绵共附生假单胞菌属菌株DEH138A中脱卤酶的分离纯化及性质表征

用硫酸铵沉淀,Q-Sepharose HP离子交换层析,Superdex 200凝胶过滤层析和Mono-Q离子交换层析方法,对从大连潮间带繁茂膜海绵中分离得到的1株假单胞菌DEH138A(Pseudomonas sp.DEH138A)中的脱卤酶进行分离纯化和酶学性质表征。结果显示,假单胞菌菌株DEH138A中含有一种能降解L-2-氯丙酸的L-2-卤代酸脱卤酶(L-DEX)。经纯化后,L-DEX亚基分子量为27.8kDa,全酶分子量为42.5kDa,推测其为一个二聚体蛋白。L-DEX最适pH值及最适反应温度分别为10.0和30℃,Km值为0.63mmol/L。L-DEX能够作用于多种2-卤代酸,而且对单溴乙酸的脱卤效果最好。DTT和EDTA对L-DEX无抑制作用,Cu2+和Co2+对L-DEX有明显的抑制作用。L-DEX具有立体选择性等独特的酶学特性,在环境修复、精细化工等领域具有潜在的应用价值。     

江米酒酒醪中凝乳酶酶学性质的初步研究

对江米酒中提取纯化得到的凝乳酶的酶学性质进行了研究.结果表明,该凝乳酶反应的最适反应温度为35～40.℃,60℃保持20.min完全失活;随着pH的降低凝乳活力提高,在pH 1～7范围内稳定,最适pH为5.2;Na+、K+对其凝乳活力表现微弱的抑制作用,而NH4+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+、Mn2+、Al3+、Fe2+有明显的促进作用.离子型表面活性剂对凝乳酶活力有明显的抑制作用,非离子型表面活性剂对凝乳活力具有明显的促进作用.多羟基化合物、β-巯基乙醇及乙二胺四乙酸(EDTA)作为酶的修饰剂对酶活力具有不同的影响.