不依赖基因序列和连接反应克隆（SLIC）方法的改进

SLIC（Sequence and Ligation Independent Cloning）是一种不依赖于基因序列和连接反应的高效基因克隆新方法. 为了进一步提高该方法的重组效率,将T4连接酶缓冲液改换成退火缓冲液,并使用相应的退火程序,可使重组效率提高至少10倍. 此外,参加重组的若干DNA片段在同一反应体系中用T4 DNA聚合酶处理,再使用相同的方法退火,其重组效率仍然可以提高至少10倍. 因此,利用本研究所建立的SLIC改进方法,不仅可以提高重组效率,而且还可以用于多DNA片段的高效重组, 减少研     

同源重组在染色体DNA基因克隆中的应用方法

同源重组是生物界普遍存在的现象，从噬菌体、细菌到真核生物都有能发生同源重组的种类。如何把同源重组应用到基因克隆中成为近年来生物学家研究的热点。本文从宿主细胞的改造、重组功能的诱导、感受态细胞的制备、线性同源载体的获得及重组体的鉴定等几个方面具体叙述这种基因克隆的新方法，从分子水平上较为详尽地介绍了同源重组在染色体基因克隆中的应用、前景展望及存在的局限性。     

重组工程法敲除恶臭假单胞菌KT2440的染色体基因

恶臭假单胞菌KT2440是在生物降解环境有机物和表达异源基因等方面具重要作用的环境微生物.基因敲除是研究基因和蛋白功能的必要手段.常规的基因敲除方法往往会烦琐耗时且易引入突变的基因克隆操作.本研究采用重组工程(即重组酶催化的PCR产物与基因组上同源片段之间的同源重组)来实现恶臭假单胞菌KT2440的基因敲除.本方法高效...     

致弱Ⅰ型MDV pp38基因同源物的克隆和序列分析

将致弱Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)感染的细胞基因组DNA的EcoRⅠ酶切产物建于Puc18质粒载体文库中,以digoxingenin标记的含有强毒GA株MDV pp38基因克隆片段作为探针,进行原位杂交反应,初步筛选出阳性重组质粒,进一步用EcoRⅠ酶切分析筛选到含pp38基因同源物的重组Puc18质粒. 序列分析表明该pp38基因同源物与pp38基因有极高的同源性,仅有1个碱基突变并导致1个氨基酸的替换.     

RecA介导的特异性DNA片段捕获

外显子捕获联合高通量测序技术在检测新的致病基因,特别是罕见的基因变异时,表现出很高的检测效率.但在具体使用过程中,探针易出现非特异性杂交,设计探针时需考虑Tm值均一性、所需初始样品量较大等问题.RecA是原核生物同源重组的中心分子,参与DNA损伤的重组修复.通过在体外模拟RecA蛋白在原核生物体内重组寻找同源序列的途径,用以捕获目标DNA分子,以期提高外显子捕获过程中的探针杂交效率和特异性.根据RecA在体内同源重组中的作用模式,先将基因组染色质片段化,再纯化DNA,设计生物素标记的特异性探针,在RecA蛋白的介导下以捕获基因组中的目的同源片段.结果显示:设计的和目标片段互补的探针高效而特异地捕获了目标DNA片段,ATP和水能够破坏RecA介导形成的三链复合体的稳定性,可以作为很好的杂交后洗脱试剂,而且水直接作为洗脱试剂可以提高洗脱目的 DNA片段的效率和纯度.     

一种通用的质粒构建方法的探索

PCR产物与克隆载体连接是基因克隆环节中重要的一步.文章介绍了一种简便,通用的质粒构建方法.此法是在PCR引物设计时,在目的片段5′端加上BsaI序列,然后通过BsaI酶切产生具有相同粘性末端的载体和插入片段,经过连接,获得重组质粒.     

用于骨移植的hCbfa1重组腺病毒载体的构建

克隆hCbfa1的cDNA基因,构建其重组腺病毒载体,以用于研究hCbfa1腺病毒载体在人造骨移植中的作用.将hCbfa1的cDNA目的片段插入腺病毒柯氏质粒PAxCAwt中,再将此质粒与腺病毒DNA末端蛋白复合物共转染293个细胞,通过同源重组构建hCbfa1重组腺病毒载体.重组得到的阳性克隆经酶切、测序鉴定正确,包装纯化后,检测得病毒滴度为2×109PFU/mL,从而成功地构建了hCbfa1重组腺病毒载体,为下一步应用到人造骨移植的转基因治疗打下了基础.     

5’端与3’端间同源长度对质粒构建的影响

5’端/3’端间同源长度对分子内同源重组质粒构建的影响还不明确.本研究以与GFO对应的五种反向引物CR1、CR2、CR3、CR4、CR5,分别扩增5’端/3’端间同源长度有10、20、30、40、50 bp的5.9 kb线性质粒pET20b-C2-GH10-C2作为模式DNA,经重组酶Exnase Ⅱ 37℃体外重组30 min,42℃热激诱导转化BL21(DE3)感受态细胞,比较转化率、质粒位置正确率、接口正确率.结果显示,同源长度30 bp DNA重组后转化子正确质粒最多,正确接口转化率3.4个/ng DNA,其次是同源长度20 bp DNA.电泳检测显示DNA重组后产生nick质粒,是转化子的来源,胞内酶修饰nick可产生基因-载体接口异常.     

基于染色体的重组工程系统的改进

重组工程是指通过重组酶催化DNA之间的同源重组,实现DNA克隆和修饰的一种基因工程技术.本研究从重组酶基因整合至大肠杆菌DH10B所获得的基于染色体的重组工程系统菌株LS-GR出发,利用菌株自身的重组工程系统和双链断裂修复功能,敲除了编码5’->3’单链DNA外切酶的recJ基因和编码3’->5’DNA外切核酸酶的sbcB基因,获得重组效率得以提高的菌株LS2002和LS2004.单链寡核苷酸修复和双链断裂修复实验表明所得菌株较LS-GR的重组效率有明显提高,对需要重组效率高的重组工程实验具有重要的应用价值.     

BnRCH同源基因耐热性分析

本实验室先前通过酵母双杂交在油菜中获得一个未知基因(BnRCH),NCBI保守区域查寻表明BnRCH蛋白含有一个RINGv(RING-variant)结构域,该结构参与多种抗逆途径.为初步探索BnRCH的作用,通过RT-PCR技术,克隆BnRCH及其在其它物种中的同源基因cDNA序列,之后将各基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中进行表达.通过IPTG诱导,western检测表明重组蛋白的相对分子量约为35 kD.进一步在高温环境(43℃)对其生长曲线测定,发现重组菌生长状态优于对照菌,说明BnRCH及其同源基因能提高微生物的耐热性.     

基因编辑方法研究进展——以大肠杆菌基因敲除方法为例

大肠杆菌是分子生物学的重要研究对象,是生产氨基酸、有机酸和重组蛋白等物质的主要微生物.在分子生物实验中,常常不需要完整的大肠杆菌基因序列,这时如何截取所需要的基因序列就成了值得研究的问题. Red同源重组是大肠杆菌基因敲除的传统方法,主要利用自身的Rec A同源重组系统编码中Rec A和Rec BCD蛋白,介导DNA进行同源重组.几经技术革新,但该系统仍然存在很多不足.基因组编辑三大技术是TALEN、ZFN和CRISPR/Cas,其中的CRISPR/Cas技术更是当今世界上最具发展前景的革命性基因修饰技术.     

高温影响拟南芥减数分裂染色质上5-甲基胞嘧啶的分布（英文）

在许多植物中,DNA甲基化的水平和分布能够影响DNA双链断裂和同源交叉在染色体上的形成和分布.在拟南芥中,高温会抑制DNA双链断裂和联会复合体的形成,从而影响同源交叉的形成和分布.然而,表观遗传修饰尤其是染色体的DNA甲基化是否会影响同源重组对高温的反应尚不清楚.研究利用针对5mC的抗体,对高温处理过的拟南芥前期染色体上5-甲基胞嘧啶（5mC）的分布进行了初步分析.在对照温度下,5mC信号主要位于4’,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色较深的染色体区域,即异染色质区域.而在高温条件下,5mC在不同的染色质区域的分布均发生了改变,这表明DNA甲基化位置在温度升高的情况下发生了改变.研究结果暗示环境温度升高可能通过改变DNA甲基化在染色体上的分布从而影响DNA双链断裂和/或同源交叉的模式.     

人乳铁蛋白阳离子多肽重组Taq DNA聚合酶的研究

本文报道了人乳铁蛋白阳离子多肽(HL-N)替换Taq DNA聚合酶N-末端结构域,构建新型重组Taq酶的研究结果.利用合成寡核苷酸,成功获得具DNA合成功能的HL-N重组Taq酶.对该重组酶的DNA合成加工、血清耐受性等测试显示,HL-N重组Taq DNA聚合酶的DNA扩增速度、扩增物产量、以及对反应体系中血清浓度的耐受性都得到显著提高.     

一种新型DNA纳米结构的构建与结晶

DNA三角形纳米结构的拐角是由DNA同源重组中的Holliday基序构成的.为进一步研究DNA三角形纳米结构,对其拐角截断并引入黏性末端到其基序上,使其能够自组装成为一种新型DNA纳米结构.对该DNA纳米结构进行凝胶电泳分析,发现其迁移速率要比DNA三角形迁移速率小.在这种没有扭曲张力的情况下,该基序只是自组装形成一个二聚体结构,而不是三聚体结构(DNA三角形).对该新型DNA纳米结构进行结晶,并合成得到了硒代核酸,同时也得到了较高质量的硒代单晶,以帮助相位测定.希望对其晶体结构进行测定研究,以便发现该新型DNA纳米二聚体结构和该Holliday基序组装的三维结构,从而更深入地认识DNA纳米材料的组装规律.     

Red/ET重组AHBA生物合成基因簇打靶载体的构建与鉴定

为确定3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)生物合成基因簇在链霉菌中与次生代谢产物的关系,运用PCR技术,从33株AHBA合酶基因阳性菌株扩增与AHBA生物合成基因簇中编码AHBA合酶(A)、氧化还原酶(O)、磷酸化酶(P)基因,获得24株AOP基因阳性菌株.根据靶基因A基因下游和P基因上游同源序列设计50 bp引物,中间插入卡那霉素抗性基因的DNA片段,进行PCR,获得外源DNA片段.经过电转化,将外源DNA片段和pKC1139-AOP重组质粒共转入含重组酶质粒大肠杆菌HS996/ pSC101-BAD-gba-(Tet).在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与重组质粒pKC1139-AOP上的AHBA基因簇的同源区域重组,构建了AHBA基因簇打靶载体.研究显示了Red/ET重组工作效率高、操作简单、精确的优点,可大大缩短构建打靶载体的时间.     

不同转导方式及载体形式对TALENs在小鼠胚胎干细胞打靶效率的研究

通过同源重组进行小鼠胚胎干细胞基因敲除是目前应用最为广泛的基因敲除技术手段,但同源重组的效率却非常低.TALEs和FokI的剪切结构域融合的TALENs可以实现高效的基因敲除.已有报导表明,TALENs识别位点的DNA序列和长度,及间隔区的长短等条件影响TALENs打靶效率.但外源载体的导入方式及载体的形式(DNA或RNA)是否以及如何影响TALENs的打靶效率还不明确.用不同的转导方式将TALENs导入小鼠胚胎干细胞中,并检测TALENs切割识别位点的效率,实验发现Lipofectamine○R2000转染的TALENs比电转化能更高效地切割目的 DNA位点,而DNA质粒或体外转录的RNA表达的TALENs切割DNA位点的效率相近.数据表明,在应用TALENs进行基因敲除时,有必要选择合适的转导方式以提高突变效率.     

水稻同源重组型质粒载体的构建

根据同源重组机制,以水稻17S-5.8SrDNA 2.5 kb 同源片段和含有MT基因、Km r 基因的外源DNA片段构建了质粒载体pURKMT,并用电激法转化水稻愈伤组织,经Km 筛选,获得了对Km 抗性明显高于基础抗性的愈伤组织.经DNA斑点杂交检测,证实外源基因已整合到水稻基因组DNA中.     

计算机辅助基因克隆的Oracle数据库系统

计算机辅助基因克隆的Oracle数据库系统利用SwissProt数据库获取已知的基因, 用 Blast程序从人类基因组序列中搜索与该基因同源的染色体DNA片段, 并将Blast返回的结果 存储于Oracle数据库. 使用者选择所感兴趣的Blast结果, 用本文所提供的算法及前端程序 合成这些DNA片段, 从而实现计算机辅助克隆新基因.     

c-Jun氨基末端激酶3结构域突变质粒的构建、鉴定与转染

为构建c-Jun氨基末端激酶3 (c-Jun N-terminal kinase3,JNK3)的p VP16-eGFP-Myc-JNK3活化环(activation-loop,A-loop)结构域突变型重组质粒,通过A-loop突变型JNK3的c DNA序列以及p VP16-eGFP-Myc的酶切位点设计引物,PCR扩增目的基因,使用限制性内切酶Mlu I与Xba I将基因克隆到p VP16-eGFP-Myc真核表达载体中,构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3(A-loop)结构域突变型重组质粒。转化后,通过双酶切鉴定与DNA测序判断是否成功构建重组质粒,使用Trans IntroTMEL Transfection Reagent转染人胚肾(human emborynic kidney,HEK) 293T细胞,通过荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况。结果表明:构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3 (A-loop)结构域突变型重组质粒,双酶切鉴定和测序结果显示构建成功; p VP16-eGFP-MycJNK3 (A-loop)成功转染HEK293T细胞且表达。鼠源JNK3结构域突变型质粒构建成功,对进一步研究JNK3结构域在相关疾病的作用和机制提供实验工具。     

硅藻DNA片段在表达质粒pMZR中再克隆的研究

用部分酶切法切开表达质粒 pMZR 中一个 HindⅢ位点后,插入了一个带 HindⅢ粘性末端的1kb 硅藻 DNA 片段重组 DNA 分子转化 E.coli LE392,对转化子中的重组 DNA 分子用酶切分析后,鉴定了1kb DNA 片段插入 pMZR 的位置。