环状芽孢杆菌中具有强启动活性DNA片段的结构与功能分析

作者曾用启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１从环状芽孢杆菌Ｃ－２菌株（ＢａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓＣ－２）中克隆到一个具有强启动功能的２．４ｋｂ片段ＢＣ６．对该片段作作的进一步缺夫分析表明,其３’端约０．７ｋｂ片段具有单独的基因启动子功能,序列分析表明ＢＣ６片段３′端有典型的原核生物的基因启动子结构,现有ＢＣ６的５’端的１．２ｋｂＸｈｉＩ片段的重组于ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲＩ位点,观察其对两侧具有不同     

环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）基因表达效率调节DNA片…

用大肠杆菌启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１从环状芽胞杆菌基因组中分离的启动子片段ＢＣ６能使无启动子的卡那霉素抗性基因恢复活性，并在大肠杆菌中获得高效表达。当用限制酶ＸｂａＩ去除其５’－端１．２ｋｂ片段后，３’－端片段仍能启动Ｋａｎ’基因表达，其抗性水平降至４００μｇ／ｍＬ，但当１．２ｋｂ片段反向回原有位置时，其抗性水平降至６００μｇ／ｍＬ。将Ｘｂ片段正向插入另一重组质粒ｐＢＣ３中融合的Ｋａｎ’ａｄｌｄ     

环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）基因表达效率调节DNA片段的研究

用大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１从环状芽胞杆菌（Ｅａｃｉｌｌｕａｅｉｒｃｕｌａｎｓｃ－２）基因组中分离的启动子片段ＢＣ６能使无启动子的卡那霉素抗性基因恢复活性，并在大肠杆菌中获得高效表达（卡那霉素抗性高达１２００μｇ／ｍＬ）．当用限制酶ＸｂａⅠ去除其５′－端１．２ｋｂ片段（命名为Ｘｂ片段）后，３′－端片段仍能启动Ｋａｎ￣ｒ基因表达，其抗性水平降至４００μｇ／ｍＬ但当１．２ｋｂ片段反向插回原有位置时，其抗性水平降至６００μｇ／ｍＬ．将Ｘｂ片段正向插入另一重组质粒ｐＢＣ３中融合的Ｋａｎ￣ｒ基因启动子的上游时，卡那霉素抗性由２００μｇ／ｍＬ上升至１０００μｇ／ｍＬ．当Ｘｂ片段反向插入时，Ｋａｎ￣ｒ基因的表达却明显受到抑制，降为１００μｇ／ｍＬ．这说明Ｘｂ片段具有正向增强而反向衰减Ｋａｎ￣ｒ基因表达的能力．用ＢＣ６片段的两个亚克隆片段与ｃ－２菌株总ＤＮＡ分别作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交时，结果显示３′－端片段以单拷贝形式存在于基因组中，而Ｘｂ片段则以多拷贝形式散布其中．由此推断Ｘｂ片段并非一定伴随该基因启动子存在．     

黄牛Sry基因5‘端调控区序列研究

采用聚合酶链式反应技术,以中国湖北雄性黄牛基因组ＤＮＡ为模板,扩增出Ｓｒｙ基因５’端调控区６８０ｂｐ和６４０ｂｐ两个片段,并分别克隆到ｐＵＣ１８上,测序拼接出完整的５’调控序列１０４０ｂｐ,该列含核心启动子和ＡＴＧ起始密码。     

构建及表达小麦高分子量谷蛋白基因5′端调控序列缺…

通过定点突变，在小麦高分子量（ＨＭＷ）谷蛋白基因５′上游调控序列的ＴＡＴＡｂｏｘ与基因翻译起始密码子ＡＴＧ之间，改变三个碱基，产生新的ＢａｍＨⅠ内切酶位点。在调控序列中，选择四个合适的内切酶，对上游序列进行缺失，分离到四个大小分别为２４００、６１０、４４０和１１０ｂｐ的含有不同调控元件的ＨＭＷ谷蛋白基因启动子，与质粒ｐＨＩ１０１．１的报告基因ＧＵＳ重组，构建了四个嵌合质粒ｐＷＧ２４００、ｐＷＧ６０     

枯草杆菌强基因启动子DNA片段的序列分析

对利用基因启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ２,从枯草杆菌ＡＳ１．３９８中克隆３个稳定的具有强启动功能的ＤＮＡ片段,进行限制酶切分析发现,ｐＢＳＵ２２和ｐＢＳＵ４３中的插入片段小于０．２ｋｂ,ｐＢＳＵ４４中的插入片段为３ｋｂ。测定结果表明,３个插入片段中都有较为典型的原核生物基因启动子序列,其中ｐＢＳＵ２２和ｐＢＳＵ４３的插入序列几乎完全相同。２     

去势耐受前列腺癌中雌雄激素对芳香化酶表达的影响及芳香化酶启动子成分的改变

去势耐受前列腺癌(Castrate-resistance prostate cancer, CRPC)的发生是进展性及转移前列腺癌治疗中的主要障碍,其中性激素在CRPC发生及进展过程中发挥着重要作用.在本实验中发现,调节雌雄激素转换的关键酶—芳香化酶转录参与的主要启动子在CRPC细胞系中发生改变:雄激素依赖前列腺癌细胞系LNCaP中芳香化酶转录的主要驱动启动子为I.4,而在CRPC细胞系LNCaP abl,PC-3和22RV1中转变为启动子PII.此外,雄激素能够上调芳香化酶在CRPC细胞系中的表达,而雌激素对芳香化酶的表达没有明显影响.上述结果提示CRPC中芳香化酶的异常表达可能影响前列腺癌进程.     

抑癌基因FHIT的克隆和序列分析

用ＰＣＲ方法，从人脑ｃＤＮＡ库中克隆ＦＨＩＴ基因，扩增得到５５３ｂｐ片段克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ载体，测定了其ＤＮＡ序列。该序列包括ＦＨＩＴ ｃＤＮＡ编码区全部４４４ｂｐ，以及５‘端５２ｂｐ和３’端５７ｂｐ非编码区序列。编程区有二处位点发生突变，第９２位密码子中的Ｃ突变成Ｇ，是同义突变，不导致氨基酸改变；     

构建及表达小麦高分子量容蛋白基因5′端调控序列缺失突变体嵌合质粒

通过定点突变，在小麦高分子量（ＨＭＷ）谷蛋白基因５′上游调控序列的ＴＡＴＡｂｏｘ与基因翻译起始密码子ＡＴＧ之间，改变三个碱基，产生新的ＢａｍＨⅠ内切酶位点．在调控序列中，选择四个合适的内切酶，对上游序列进行缺失，分离到四个大小分别为２４００、６１０、４４０和１１０ｂｐ的含有不同调控元件的ＨＭＷ谷蛋白基因启动子，与质粒ｐＢＩ１０１．１的报告基因ＧＵＳ重组，构建了四个嵌合质粒ｐＷＧ２４００、ｐＷＧ６００、ｐＷＧ４４０和ｐＷＧ１００．经基因枪、微束激光和ＰＥＧ等方法将ｐＷＧ２４００转化玉米胚乳悬浮细胞，ＧＵＳ基因获得表达．这为进一步研究ＨＭＷ谷蛋白基因的调控机理奠定了基础．     

反式激活HIV-1 LTR的HHV-6基因片段B701的缺失研究

ＨＨＶ－６在体外可以激活ＨＩＶＬＴＲ引导的基因表达［１］，其基因组中一基因片段Ｂ７０１已被证明与这种激活作用有关［２］．Ｂ７０１编码１４３个氨基酸的蛋白质，可与ＨＨＶ－６基因组中其它基因片段协同作用提高对ＨＩＶＬＴＲ的激活效力．对Ｂ７０１进行缺失突变，得到突变体ＲＳＶ－Ｂ７０１－ｄ１（３′端缺失１８１个ｂｐ）、ＲＳＶ－Ｂ７０１－ｄ６（３′端缺失３５３个ｂｐ），将这两个缺失突变体分别与ＨＩＶ－Ｌｕｃ共转染受体细胞，通过ＬＵＣ活性分析发现，缺失突变体ｄ１、ｄ６不但仍具有激活能力，而且ｄ６的激活能力要远远大于ｄ１．二级结构预测初步揭示了Ｂ７０１对ＨＩＶ－ＬＴＲ的反式激活作用机制，为阐明ＨＨＶ－６基因产物与ＡＩＤＳ的病理关系提供了依据．     

满江红鱼腥藻glnA基因上游调控区的克隆及其序列分析

以满江红鱼腥藻（Ａａｃ）提取总ＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ技术,扩增得到其谷氨酰胺合成酶基因（ｇｌｎＡ）上游区．经酶切得到４０９ｂｐ的片段,并将其连接到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡｋｓ＋上测序．将测序结果与Ａｎａｂａｅｎａ７１２０调控序列比较,有９８２％的同源性．在上游调控中也具有ｎｉｆｌｉｋｅ和Ｅ．ｃｏｌｉｌｉｋｅ启动子,值得注意的是,调节蛋白ＶＦ１的结合位点正好位于ｎｉｆｌｉｋｅ启动子上．所克隆的片段不但对蓝藻固氮、泌氨的基因调控研究具有意义,也对表达载体的构建具有实用价值．     

牛α—s1酪蛋白基因3‘端DNA的PCR扩增,克隆及鉴定

本研究以牛血总ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增牛α－ｓ１酪蛋白基因的５＇端３．６ｋｂＤＮＡ片段和３＇端１．５ｋｂＤＮＡ片段的调控区序列，得到了相应的特异性扩增片段．用Ｋｌｅｎｏｗ处理后，将两个扩增片段分别与经Ｓｍａｌ酶切的ｐＵＣ１８质粒载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＪＭ１０９．在含有Ｘ－ｇａｌ，ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的选择培养基上培养．从白色菌落中提取质粒ＤＮＡ，进行限制酶切鉴定．结果得到一个插入有１．３ｋｂＤＮＡ片段的阳性克隆．对其进行部分序列分析表明，该片段为５＇端缺失约１７０ｂｐ的牛α－ｓ１酪蛋白基因３＇端及下游区序列．     

用PCR法构建乳腺特异性表达非乳蛋白基因的研究

将ＰＣＲ法分别从绵羊和人血基因组ＤＮＡ中扩增出的绵羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５＇端调控区８９８ｂｐ的片段和人骨髓单核细胞表面分化抗原ＣＤ１４基因（ｈＣＤ１４）成熟肽１２４５ｂｐ的片段连接。连接片段插入ｐＵＣ１９ ＥｃｏＲＩ－ＫｐｎＩ位点，构建成ｐＢＬＧ－ｈＣＤ１４质粒。该质粒经ＫｐｎＩ及ＣｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ酶切、ＰＣＲ法扩增ＢＬＧ和ｈＣＤ１４分析后，进一步用＾３２Ｐ－ＢＬＧ探针杂交确证。用Ｅｃ     

水稻RSSG8基因启动子与GUS融合基因的构建及在烟草中的瞬间表达

使用染色体步移(Genome walking)法，从籼稻(Oryza sativa subsp．indica)桂朝2号基因组中克隆到长度为471bp的水稻精细胞优势表达基因RSSG8的启动子片段R8PN，并进行了全序列测定和分析．该段序列中含有3个CAAT-box，6个Gobox和多种植物顺式作用元件，但没有发现典型的TATA-box，推测为一种特殊的启动子结构，为了鉴定RSSG8基因的基本启动子元件，将二条长度不同的5’端侧翼区缺失体(分别长471bp，260bp)定向插入载体pBI121中，取代原有的CaMV 35S启动子，构了驱动报告基因GUS的植物表达载体pRGUS1，pRGUS2，通过农杆菌介导的瞬时表达法转化烟草叶片和花粉，快速鉴定启动子片段中起关键作用的区域，结果显示两个缺失片段都能启动GUS的表达，可以初步判定这两个片段具有启动子功能。     

Nodal基因5′末端侧翼序列启动子的分析

为了鉴定Ｎｏｄａｌ基因的基本启动子元件,将Ｎｏｄａｌ基因５′侧翼序列的各缺失片段构建以荧光素酶为报告基因的重组质粒。用这些拾报告基因的质粒转化Ｆ９细胞并测定了它们的瞬时表达荧光素酶海性。Ｎｏｄａｌ基因的基本启动子元件位于转录起始位点上游约６０ｂｐ,其中含有一个位于－３３ｂｐ处的ＴＡＴＡｂｏｘ,它对于转录起始起着重要作用。这个基本启动子在多种细胞类型中都有活性,但其活性不强。     

黑曲霉(Aspergillus niger)三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GPD)的序列测定与同源性分析

ｐＡＮＧＰＤ是用构巢曲霉ＧＰＤ基因片段为探针,从黑曲霉基因组文库中筛选到的一个三磷酸甘油醛脱氢酶基因（ＧＰＤ）阳性克隆．作者对该阳性克隆进行了亚克隆和序列测定,结果表明,基因片段总长２４４１个核苷酸（ｎ．ｔ）,其中５’－端非编码区长９８１ｎ．ｔ,编码区（从起始密码子ＡＴＧ到终止密码子ＴＡＧ）长１４４６ｎ．ｔ,３’－端非编码区长２４ｎ．ｔ,基因启动子区含有ｇｐｄ－盒和ＣＴ－盒序列,但无明显的ＣＡＡＴ盒和ＴＡＴＡ盒序列．ＧＰＤ基因由７个外显子和７个内含子构成,外显子全长１００８ｎ．ｔ,编码的蛋白质长３３６个氨基酸残基．通过序列比较分析,发现该基因与构巢曲霉的ＧＰＤ基因有许多相似之处;它们的基因启动子序列都含有ｇｐｄ－盒和ＣＴ－盒,其同源性分别为９６％和６５％;推测的两个ＧＰＤ蛋白的氨基酸同源性高达９０％;两个基因所含内含子数目及位置相同．     

卡介苗中具启动子活性片段克隆及分析

利用启动子探针型质粒ｐＫＫ２３２－８从卡介苗染色体ＤＡＮ的ＢａｍＨＩ酶切片段中克隆到４个具启动功能的ＤＮＡ片段,测定各重组子对氯霉素（Ｃｍ）的抗性,其中含３．３Ｋｂ外源片段的重组质粒ｐＢＣＧ２大肠杆菌转化子在ＬＭ培养基上对Ｃｍ抗性可达１７０×１０－６ｇ／ｍＬ,作了该片段的限制性酶切图谱．对ｐＢＣＧ２利用ＳａｌⅠ位点,亚克隆出４种部分重叠的具启动功能的ＤＮＡ片段,这４种重组质粒分别命名为ｐＢＣＧ２－１,ｐＢＣＧ２－２,ｐＢＣＧ２－６和ｐＢＣＧ２－８,并分析了其中插入片段的大小及其转化子对Ｃｍ的抗性．将ｐＢＣＧ２－２的ＳａｌⅠ外源片段插入到分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３,获得一个可在卡介苗中表达ｌａｃＺ基因的重组子ｐＥＢ２２．斑点杂交实验证明,具有启动功能的ＤＮＡ片段来源于卡介苗的染色体ＤＮＡ．结果表明克隆到一个对大肠杆菌和卡介苗均具启动子活性的ＤＮＡ片段     

妊高征候选基因EDN1多态性的初步研究

目的：内皮素－１基因是妊高征的候选基因之一。通过研究该基因ＴａｑⅠ位点在中国人群中的多态性,探讨中国人群中ＥＤＮ１与妊高征的关系。方法：根据ＥＤＮ１第４内含子中多成性片段的有关序列,设计相应引物,建立检测该多态性片段的ＰＣＲ技术技术。结果：２６个样品５２个内皮素－１基因ＴａｑⅠ位点等位基因中Ｔ１的频率为８０．９％,Ｔ２的频率为１９．１％。结论：显示中国汉族人群内皮素－１基因中存在着ＴａｑⅠ酶切位点     

豌豆中GPAT基因编码cDNA的克隆及分析

参照国外报道的豌豆ＧＰＡＴ基因ｃＤＮＡ序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，通过ＲＴＰＣＲ技术，从云南地方栽种的豌豆品种中分离到了ＧＰＡＴ基因的编码ｃＤＮＡ片段，并将其纯化后直接克隆到ｐＧＥＭＴ载体系统中，经ＮｃｏⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切鉴定，所得的重组质粒中含有１３８０ｂｐ左右的片段．采用ＰｓｔⅠ，ＨｉｎｄⅢ两种限制性内切酶进行酶切，酶切图谱分析表明所克隆的豌豆ＧＰＡＴ基因编码ｃＤＮＡ的酶切图谱与国外所报道的该基因ｃＤＮＡ的酶切图谱一致，暗示了该基因在进行上具有一定的保守性．