苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64蛋白的优化表达

研究培养基成份、pH值、接种量、诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达水平的影响.SDS-PAGE电泳分析结果表明:在37℃的LB培养基中培养3h,用终浓度为0.3mmoL/L的IPTG于30℃诱导5h时表达水平最高.苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Gp64重组蛋白在大肠杆菌中的优化表达为深度解析其在病毒感染过程中的功能奠定了基础.     

核型多角体病毒gp67基因的研究

核型多角体病毒是重要的杆状病毒，在其生活周期中存在有包涵体产生的病毒粒子和出芽病毒粒子两种形式的子代病毒．出芽病毒能有效地感染血腔细胞，并且发现，它的感染能力决定于病毒粒子囊膜上的ｇｐ６７蛋白，ｇｐ６７蛋白为酸激发的膜融合作用所必需．ｇｐ６７蛋白还是囊膜上唯一由病毒编码的膜蛋白．序列分析表明，ｇｐ６７蛋白与木瓜蛋白酶同源，蛋白分子的主要功能区有Ｎ端的信号肽序列，Ｃ端的转膜固着序列，以及中间的外作用区域，膜融合作用区段位于外作用区域上．ｇｐ６７蛋白在胞质合成后，会发生寡聚化及糖基化其他．ｇｐ６７基因的转录存在有依赖于ＴＡＴＡ盒和不依赖于ＴＡＴＡ盒两种转录因子，并且这两种方式有部分重叠现象．利用ｇｐ６７蛋白的基因工程正引起人们的重视     

家蚕核型多角体病毒orf121克隆以及非翻译区分析

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)orf121是Ac145的同源基因,同为杆状病毒11 K基因家族,但其功能尚不明确.克隆了BmNPV orf121基因并对其侧翼序列以及转录时相进行分析.结果发现orf121与GenBank发表的T3株一致,orf121编码的蛋白N端含有一段疏水性很强的氨基酸,C端有一个几丁质结合域基序...     

重组斜纹夜蛾核型多角体病毒的构建和初步筛选

斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura multinucleocapsid nucleopolyhedroviruse,SpltMNPV)日本株(C3)(又命名为SpltMNPV Ⅱ)是Kamiya等从日本全国各地野外感病幼虫收集、分离到189个SpltMNPV克隆中繁殖率和毒力极强的一种新型病毒株.本研究在SpltMNPV Ⅱ的基础上构建了egt缺失的,多角体启动子启动的,BmK ITa1成熟肽和增强型绿色荧光蛋白(egfp)融合表达的重组移载体psk-△egt-pph-BmK ITa1-egfp,并通过共转染初步筛选出重组病毒感染的荧光细胞.成果为进一步研制高效重组SpltMNPV生物杀虫剂提供了可行性.     

应用核型多角体病毒载体在家蚕和家蚕培养细胞中高…

将人尿激原ｃＤＮＡ分别插入家蚕核型多角体病毒转移载体ｐＢＫ２８３和ｐＢＦ４中，构建成两个重组质粒。所构建的这两个重组质粒与野生型家蚕核型多角体病毒ＤＮＡ共转染家蚕培养细胞，经病毒斑实验筛选出含ｐｒｏ－ＵＫ ｃＤＮＡ的稳定重组病毒株ＢｍＮＰＶ－ｐｋ１和ＢｍＮＰＶ－ｐｋ２。将此两株蛋白平板溶圈测活法和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法分析细胞培养上清及细胞和家蚕的体液及组织，证实均有ｐｒｏ－ＵＫ表达。家蚕培养细胞的     

柞蚕核型多角体病毒fgf基因的克隆和分析

为获得柞蚕NPV的全基因组序列,在柞蚕尸体中分离纯化柞蚕NPV,提取其基因组DNA,分别建立ApNPV DNA的HindⅢ和SalⅠ基因文库．对插入片段进行测序,经过同源性分析发现一个与人源fgf基因相似的基因,其读码框含有185aa．核苷酸和氨基酸同源性比较的结果表明：在genebank中没有同源性极高的序列,是个新基因;柞蚕NPV的fgf基因与云杉卷叶蛾NPV的同源性较高,分别为56．1％和45．9％,而与家蚕NPV及AcNPV的同源性相对较低,说明柞蚕NPV与家蚕NPV在进化上亲缘关系较远．该基因的克隆为进一步研究其在病毒感染过程中的作用打下基础．     

芹菜夜蛾核型多角体病毒D克隆株DNA片段的克隆与鉴定

实验提取芹菜夜蛾核型多角体病毒D克隆株DNA，5种限制性内切酶消化，并对Eco RⅠ酶切片段进行分子克隆．结果表明，芹菜夜蛾核型多角体病毒D克隆株分子量为113．78kb；实验成功克隆出10个病毒DNA Eco RⅠ酶切片段．上述结果为芹菜夜蛾核型多角体病毒D克隆株的分子生物学分析提供了基础材料．     

斜纹夜蛾核型多角体病毒日本株(C3)p10基因的克隆及序列分析

从斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura mukieapsid nucleopolyhedrovirus，Splt MNPV)日本株(C3)基因组中克隆了p10基因．核苷酸序列分析表明，该克隆片断涵盖了318bp的读码框及5’端启动子区191bp和3’端终止区62bp的序列．在起始密码子ATG上游-63～-59bp处有一杆状病毒晚期和晚晚期启动子基序TAAG．联配分析表明，Splt MNPV日本株(C3)的核苷酸序列和氨基酸序列与其它9种核多角体病毒的同源性有较大差异．以p10基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树将家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuchopolyhedrovirus，BmNPV)与苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multicapcid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)归到同一分枝，这与以gp37基因和egt基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树结果一致．     

形成多角体家蚕重组病毒通用转移载体构建

从家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）通用转称载体ｐＢＫ２８３和粉纹夜蛾核型多角体病毒（ＴｎＮＰＶ）转移载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列出发，构建了一个７．２ｋｂ能形成多角体且可以用于克隆含不同读码框外源基因的ＢｍＮＰＶ通用转移载体系列ｐＢＭＸ３．ｐＢＭＸ３系列以ＢｍＮＰＶ多角体结构基因上游的１．９ｋｂ和下游１．３ｋｂ的片段作为与ＢｍＮＰＶ基因组进行体内同源重组的同源序列；ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列的ＳＸＩＶ双启动子用于外源基因的表达；ＡｃＮＰＶ的多角体基因作为重组病毒形成多角体的基因．以ＢｍＮＰＶ－ＬａｃＺ（ｏｃｃ－ｇａｌ＋）为出发株病毒，ｐＢＭＸ３系列的重组病毒筛选有ｏｃｃ＋和ｇａｌ－两个遗传标记     

甜菜夜蛾核多角体病毒（SeMNPV）gp 37基因的克隆及序列分析

通过鸟枪法克隆了甜菜夜蛾核多角体病毒（SeMNPV)基因组DNA EcoR I酶切的2．2kb片段,序列分析表明,该片段含有gp37基因,SeMNPV gp37基因的开放阅读框为801个核苷酸,编码268个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为30400,在gp37基因起始密码子上游有一典型的杆状病毒晚期基因启动子序列ATAAG,同其它昆虫杆状病毒和昆虫痘病毒GP37／Fusolin蛋白的比较结果表明,SeMNPV GP37与已知gp37/fusolin基因的氨基酸序列同源性较高（50－68％）,在其蛋白序列内存在类似的保守区和可能的N－连接糖基化位点,在SeMNPV gp37基因下游存在一个完整阅读框和部分get基因序列。     

质型多角体病毒在家蚕体内入侵与复制研究

采用在家蚕活体内研究家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的入侵增殖复制过程,探讨BmCPV的入侵过程和增殖复制机制。实验用健康的三龄起蚕经口接种BmCPV后不同时间取中肠后部固定,制作电镜样品,在透射电子显微镜下观察,结果发现BmCPV病毒被食下1.5 h后,在中肠上皮组织圆筒形细胞微绒毛之间有病毒粒子存在,6 h后病毒进入微绒毛内,并向细胞质移动,9 h后观察到圆筒形细胞质中有病毒粒子。作者认为病毒入侵是以整个病毒粒子穿越中肠围食膜,吸附并进入微绒毛,感染圆筒形细胞,与前人病毒入侵只是髓核进入细胞,而病毒衣壳仍留在细胞外的推测不同。随后病毒核心物质进入细胞核,启动复制循环。经过隐潜期后病毒复制,在感染24 h后,细胞质中形成病毒发生基质,子代病毒开始形成,逐渐增多。感染48 h后,圆筒形细胞质中的多角体蛋白逐渐沉积并将病毒粒子包埋,最终形成新的多角体。     

一个家蚕基因组MAR的克隆及其初步分析

家蚕（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）基因组大片段ＤＮＡ经ＢａｍＨＩ完全酶解后,克隆到质粒ｐＵＣ１８中而构建成一个家蚕基因组文库．通过与家蚕细胞核基质的体外结合,从该文库中筛选到一个包含ＭＡＲ的克隆ｐＣ１１ｅ,其中外源插入片段Ｃ１１ｅ长约２．３ｋｂ．Ｃ１１ｅ的限制性酶谱分析及其酶切片段的体外结合实验表明,ＭＡＲ位于Ｃ１１ｅ上的ＳｐｈＩ和ＨｉｎｃⅡ位点之间,长１．０ｋｂ．由于这是家蚕中发现的第一个ＭＡＲ,因此我们称之为ＢｍＭＡＲ１．进一步借助ＤＮａｓｅＩ敏感性分析和ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ,对ＢｍＭＡＲ１在家蚕细胞内与核基质结合的情况以及它与人β干扰素（ｈｕＩＦＮ－β）基因５′上游ＭＡＲ之间的同源性进行了研究．     

斜纹夜蛾NPVp74基因的克隆及部分序列分析

以含ｐ７４基因的ＡｃＮＰＶＥｃｏＲⅠ－Ｐ片段作探针,与ＳｌＮＰＶ基因组在非严格条件下进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,将ＳｌＮＰＶｐ７４基因定位于４９００ｂｐ的ＳｌＮＰＶＸｈｏⅠ－Ｐ片段．对ＳｌＮＰＶＸｈｏⅠ－Ｐ片段中的一段９４０ｂｐ的ＤＮＡ片段进行序列测定,通过ｉｎｔｅｒｎｅｔ经ＢＬＡＳＴ与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ中的ｄａｔａｂａｓｅ比较分析发现,序列中的一段２４３ｎｔ序列与ＡｃＮＰＶｐ７４基因有６０％的同源性,一段８１ｎｔ序列与ＡｃＮＰＶｐ７４基因的同源性高达７９％．与ＣｆＮＰＶｐ７４相比,２段２６４ｎｔ和１００ｎｔ序列分别有６０％和７１％的同源性．测得序列中的部分序列与ＢｍＮＰＶ、ＯｐＮＰＶｐ７４基因也有高达５８％～７８％的同源性．同时,这部分序列编码的氨基酸与ＡｃＮＰＶ及ＯｐＮＰＶＰ７４蛋白的氨基酸序列也有很高的同源性．结果表明所测序列的一部分为ＳｌＮＰＶＰ７４蛋白Ｃ－端的编码序列．     

美国白蛾核型多角体病毒的研究进展

美国白蛾(Hyphantria cunea(Drury))属鳞翅目(Lepidoptera)灯蛾科(Arctiidae),是一种重要的国际性检疫害虫,从1979年入侵以来,对我国林业和园林绿化造成重大危害。美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea Nucleopolyhedrovirus,HcNPV)生物杀虫剂能有效控制寄主美国白蛾种群的数量,在生物防治中起到了重要的控害作用,具有重要的经济、生态和环保价值,应用前景十分广阔。从侵染特点、致病性、流行病毒学、基因组特点及应用前景等方面综述了美国白蛾核型多角体病毒的研究进展。     

斜纹夜蛾核多角体病毒egt基因的克隆和部分序列分析

用ＡｃＭＮＰＶｅｇｔ基因中的保守区部分片段为探针,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交确定ＳｌＭＮ－ＰＶｅｇｔ基因的位置在ＰｓｔⅠ４９７０ｂｐ和ＸｂａⅠ２６００ｂｐ的片段上．采用双链ＤＮＡ序列分析方法测序,在２６００ｂｐ片段上的ＥｃｏＲⅠ位点两侧得到５９４ｂｐＤＮＡ碱基序列,用计算机ＤＮＡＳＩＳ和ＰＲＯＳＩＳ软件,将５９４ｂｐＤＮＡ碱基序列所推测的氨基酸序列与ＡｃＭＮＰＶ和ＳｌｉＭＮＰＶ的ｅｇｔ基因氨基酸序列进行同源比较,其同源性分别为４５％和８６．５％．     

SlNPV多角体蛋白基因的序列分析

ＳｌＮＰＶ多角体蛋白基因的开放读码框为７５０ｂｐ,编码２４９个氨基酸的蛋白质,是目前所发现的最长的多角体蛋白基因．ＳｌＮＰＶ多角体蛋白Ｍｒ＝２９２３６,其氨基酸序列与其它核多角体病毒的多角体蛋白氨基酸序列有高度同源性．     

SlNPV PK基因的部分序列分析

ＳｌＮＰＶ基因组ＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢ－Ｘｂａ片段上含有部分的ＰＫ基因，ＳｌＮＰＶＰＫ的氨基酸序列与ＨａＮＰＶ，ＨｚＮＰＶＳｐｌｉＮＰＶ，ＡｆＮＰＶ，ＡｃＮＩＶ，ＬｄＮＰＶＰＫ氨基酸序列的同源性分别为４５％，４４％，８９％，３７％，３８％和３７％，其上含有蛋白激酶的特征序列ＩＶＨＡＮＤＶＫＬＥＮＶＬ。     

单头饲养斜纹夜蛾增殖S1NPV病毒的研究

使用人工半合成饲料大规模单头饲养斜纹夜蛾幼虫，增殖核型多角体病毒，通过不同接种浓度、接种龄期、饲养温度以及不同饲料的比较，遴选出当３龄幼虫接种的病毒浓度为３．８５×１０＾５ＰＩＢｓ／ｍＬ，４龄幼虫接种的病毒浓度为３．８５×１０＾７ＰＩＢｓ／ｍＬ时，病毒产量最高，４龄幼虫接种增殖病毒的最适温度为２４－２７℃，人工半合成饲料饲养幼虫增殖病毒效果优于天然饲料，同时，罹病虫尸热处理瑟其病毒产量之间，有显     

家蚕促咽侧体素受体基因克隆及发育表达

文章克隆得到家蚕(Bombyx mori)神经肽促咽侧体素受体基因(Allatotropin receptor,BommoATR),开放阅读框全长为1 254 bp,编码416个氨基酸.Bommo-ATR氨基酸序列的二级结构预测为7次穿膜蛋白,符合GPCR家族成员的典型特征.实时荧光定量PCR结果表明,家蚕脑-咽下神经节复合体中的ATR mRNA在5龄幼虫期表达量最高,其次为蛹后期,蛹前期和成虫阶段表达量最低.其中5龄幼虫第2天表达量最高,1～5 d持续维持较高的表达水平,这可能与保幼激素的合成有关.