水稻bZIP蛋白REB与水稻中sbe1和waxy基因5''''上游区的相互作用

水稻淀粉分支酶（SBE1）和结合淀粉粒的淀粉合成酶（GBSS）分别负责水稻胚乳中支链淀粉与直链淀粉的合成,编码这两个酶的sbel和waxy基因主要都在胚乳中表达.在水稻sbel基因5＇上游区中找到了一个能与水稻胚乳核蛋白结合的53bp片段C53,而且这种结合受到水稻waxy基因5＇上游区的Ha-2片段竞争.进一步的实验证明水稻bZIP蛋白REB可以结合sbel基因中C53片段中的2个ACGT元件G-box和Hex,并且REB也能结合waxy基因中Ha-2片段的3个ACGT元件:WG1,WG2和 WG3,其中WG1元件能强烈地竞争Hex元件与REB蛋白的结合.这提示水稻sbel基因与waxy基因在胚乳中的表达受到像REB这样的bZIP类转录因子的协同调控.     

水稻bZIP蛋白REB与水稻中sbe1和waxy基因5′上游区的相互作用

水稻淀粉分支酶(SBE1)和结合淀粉粒的淀粉合成酶(GBSS)分别负责水稻胚乳中支链淀粉与直链淀粉的合成, 编码这两个酶的sbe1和waxy基因主要都在胚乳中表达. 在水稻sbe1基因5′上游区中找到了一个能与水稻胚乳核蛋白结合的53 bp片段C53, 而且这种结合受到水稻waxy基因5′上游区的Ha-2片段竞争. 进一步的实验证明水稻bZIP蛋白REB可以结合sbe1基因中C53片段中的2个ACGT元件G-box和Hex, 并且REB也能结合waxy基因中Ha-2片段的3个ACGT元件: WG1, WG2和WG3, 其中WG1元件能强烈地竞争Hex元件与REB蛋白的结合. 这提示水稻sbe1基因与waxy基因在胚乳中的表达受到像REB这样的bZIP类转录因子的协同调控.     

玉米Cat1基因顺式元件ABRE2结合蛋白ABP9的基因克隆及功能分析

构建了授粉后17d(17dpp)的玉米幼胚cDNA基因文库，用玉米Catl基因顺式元件ABRE2通过酵母单杂交的方法筛选文库，获得3个完全相同的阳性克隆，命名为ABP9，用5′RACE的方法得到了该基因的全长cDNA序列，研究结果表明，ABP9属于bZIP类转录因子，与玉米Catl基因顺式元件ABRE2具有结合特异性，且在酵母细胞中具有转录激活功能。     

胚乳特异sbeⅡa启动子在小麦中的评价及特性分析

淀粉的合成是一个复杂的生化过程. sbeⅡa基因是淀粉合成过程中的关键酶基因之一, 在小麦籽粒成熟过程中对淀粉, 尤其对支链淀粉的生物合成调控起重要作用. 为了解sbeⅡa基因的调控机理及其胚乳特异表达特性, 利用APCR方法克隆了sbeⅡa启动子3094 bp片段, 并对该片段进行测序, 同时利用GUS瞬间表达体系对sbeⅡa启动子序列进行不同片段的功能缺失研究. 研究结果表明, 3094 bp序列(存在于sbe.g融合体中)具有稳定的启动子活性, 而5′或3′缺失体的启动子活性明显降低. 在sbeⅡa启动子中间缺失体中, 一些缺失体仅有微弱活性, 但sbe.e在缺失–1579~–1210 bp片段情况下, 却具有比sbe.g(含启动子全长序列)还要高的启动子活性. 研究初步证明, 一些固定序列(motifs), 如 –300 bp因子、G盒以及醇溶蛋白盒(Prolamin box)等作为正调控因子在决定启动子胚乳特异表达模式中是必需的, 而且在–1579~–1210 bp片段中也存在一些负调控因子或固定序列. 在瞬间表达检测体系中, 小麦胚乳组织年龄对检测结果有着重要影响.     

肝氨甲酰磷酸合成酶I基因转录起始位点的测定

氨甲酰磷酸合成酶I(CPSI)是尿素循环的第一个酶,主要存在于肝细胞线粒体中,是肝组织特异酶,与肝细胞的分化有关.我们曾观察到在大鼠肝癌诱发过程中,CPSI酶活性降低,实验证明癌变过程中CPSI基因表达的异常与基因转录调控可能有关.真核基因的转录的调控是通过反式作用因子(trsns-acting factor)与顺式作用元件(cis-acting element)的相互作用而实现的.顺式作用元件多存在于转录起始位点的5′端上游,对基因转录有调控作     

水稻过敏原基因cDNA原核表达产物的功能分析

在大多数的禾谷类植物中,如小麦、高梁、玉米等,广泛存在着抑制α淀粉酶的蛋白,它们属于禾谷类植物α淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂家族.长期以来人们认为在水稻中没有α淀粉酶抑制剂.近年来有人从水稻胚乳中分离到一类称为水稻过敏原(ＲｉｃｅＡｌｌｅｒｇｅｎ)的蛋白,分子量约14～16ｋｕ[1],由一个多基因家族编码[2].根据基因序列比较的结果人们把水稻过敏原归入α淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂家族,但对它们是抑制α淀粉酶还是抑制胰蛋白酶尚不清楚.我们通过ＲＴＰＣＲ从水稻未成熟种子中扩增并克隆了一个水稻过敏原基因ＲＡ17[3],并将其转到原核表达载…     

调控水稻异倍性杂交种子败育的相关基因分析

MADS29是控制水稻(Oryza sativa L.)种子饱满程度的基因,它通过调控母体组织细胞退化和维持体内激素平衡来影响种子发育.水稻异倍性杂交往往产生败育种子,为了探讨MADS29等种子发育相关基因是否参与其调控,本研究以4份水稻材料(2个二倍体;2个四倍体)构建4个自交组合(对照)和8个杂交组合(正反交),对花粉粒育性、花粉管萌发及伸长、种子发育及MADS29等相关基因表达进行分析.结果表明:(1)异倍性杂交均可正常受精,但杂交种子败育;(2)石蜡切片结果显示,授粉后3 d(3 day after pollination,3 DAP),与对照相比,4n×2n胚乳已进入细胞化时期,但细胞数量较少;而2n×4n胚乳处于合胞体时期,游离核周围未形成细胞壁,胚乳细胞化时期滞后;(3)实时荧光定量PCR(q RT-PCR)表明,6 DAP和8 DAP,MADS29、生长素基因和母体组织细胞程序化死亡(PCD)相关基因的相对表达量在杂交种子中均明显高于对照;淀粉合成基因在杂交种子中的相对表达量显著低于对照.本实验结果表明,在水稻异倍性杂交中,MADS29高表达,生长素基因和母体组织PCD相关基因表达上调,淀粉合成相关基因表达下调,导致胚乳发育异常、种子败育,说明MADS29的高表达导致异倍性杂交种子败育,是一种有别于二倍体水稻种子发育的新型调控方式.     

C3—C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶P—蛋白亚基上游调控序列在转基因水稻中的表达

将C3-C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶(GDC)P-蛋白亚基基因(gdcsP)的上游调控序列与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因编码区以及CaMV终止子融合,构建植物表达载体.采用农杆菌介导方法转化水稻,并在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.结果表明,在水稻中gus嵌合基因特异地在木质部和韧皮部表达,在不同器官及组织中表达活性也有所差异,其中以根中最高,茎秆次之,叶再次,而在成熟胚乳中没有表达.在转基因水稻中,gdcsP启动子的表达也受水稻发育时期的调控,随植物组织成熟度的增加而降低.     

JUN和FOS基因增加水稻prolamin 4a基因的表达

水稻prolamin基因的表达具有发育(开花后种子成熟过程中)和组织(胚乳)的特异性,是研究基因表达调控的理想材料。目前,关于水稻prolamin cDNA和13,10kD prolamin的基因已经定序,而对其表达特异性在分子水平上的机理,尚未见报道. 周先锦、范云六报道了prolamin 4a基因启动子的序列并在转基因烟草植株中证实了该启动子的发育和组织特异性表达功能。该启动子属于13kD prolamin基因启动子,具有与     

水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因（CCoAOMT）达特性分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是木质素生物合成途径中的关键酶．从水稻(Oryza sativa L ssp japonica)中分离了CCoAOMT基因家族的3个成员OsCOA1，OsCOA20和OsCOA26．序列分析表明，OsCOA1基因由4个外显子和3个内含子组成，OsCOA20和OsCOA26则具有3个外显子和2个内含子．这3个基因与其他植物同类CCoAOMT氨基酸同源性较高，达75．43％，并具有CCoAOMT基因特有的保守序列元件．系统进化树分析表明，OsCOA1与玉米中CCoAOMT具有较近的亲源关系，OscOA20和OsCOA26则属于另一分支．Northern印迹和组织原位杂交结果显示，3个基因的mRNA在水稻的各组织均有积累，在幼叶的厚壁组织和维管束大量表达，说明该基因家族的3个成员与水稻的木质化进程关系密切．     

利用安全性转基因技术导入反义蜡质基因降低稻米直链淀粉含量

利用安全性转基因技术中的共转化法, 将分别含有p13W₄双元载体(含有潮霉素抗性基因、gus报告基因以及反义蜡质基因片段)和p13W₈双元载体(无潮霉素抗性基因和gus报告基因, 只含有反义蜡质基因片段)的根癌农杆菌以1:9的比例混合导入超2-10高产水稻新品系中, 获得34棵转基因植株. PCR分析转基因T₀代植株, 结果显示, 有15株是共转化植株, 共转化率为44.1%. 利用p13W4双元载体上的gus报告基因从T₁代种子中淘汰具有报告基因及抗性标记基因的转基因后代, 再利用PCR检测从T₁代植株中获得只有反义蜡质基因的植株. Southern blot杂交分析证实, p13W₈双元载体T-DNA已整合进入无抗性标记及报告基因的转基因后代基因组中. T₂代成熟种子直链淀粉含量分析显示, 转基因植株糙米直链淀粉含量比对照有不同程度的下降, 幅度最大的比对照降低28.61%. 由于获得的转基因后代只有目的基因而无抗性选择标记基因和报告基因, 而且水稻中的稻米直链淀粉含量已降低, 它们既可被用于筛选软米材料, 也可视为是能够用于其他水稻稻米食味品质改良的水稻新资源.     

水稻金属硫蛋白核基因的克隆及其序列特征

经ＲＮＡ杂交分析发现ｒｉｃＭＴ基因在水稻茎部高效特异表达,其表达是叶片中的１００多倍,暗示出该基因的５‘上游可能贮藏着１个高效特异表达的启动子。为了弄清ｒｉｃＭＴ基因的表达调控及启动子结构特征,从水稻基因组文库中筛选出ｒｉｃＭＴ的核基因克隆,并测出了４０８４ｂｐ序列,其中包括２９７０ｂｐ的５‘上游区,约６９０ｂｐ的转录区和４２０ｂｐ的３’下游区。     

alc基因开关系统在水稻中的建立和优化

对以构巢曲霉的alc调控元件为基础构建的酒精诱导系统（alc系统）可在转基因水稻中调控GUS编码基因的表达进行了详细研究。结果表明。在转基因水稻中，非诱导状态下alc系统控制下的报告基因没有表达；通过根部浇灌方式施加酒精后则可诱导报告基因的表达,alc系统的表达活性依赖于酒精浓度：0.1%的酒精不能诱导alc系统，而0.5%的酒精可使GUS活性提高大约70倍。2%的酒精浓度下alc系统的表达活性最高，是诱导前的120倍左右；并且这些浓度的酒精对水稻均未观察到生理毒害作用。酶动力学研究表明，诱导48h后，GUS编码基因开始表达；96h后，GUS活性达到最高，可达诱导前的130倍左右。120h后GUS活性开始降低，对诱导前后的叶片进行组织化学染色检测，结果也证实alc系统可以严谨地控制外源基因在水稻中的表达。     

高粱光调控基因psbA5′-末端非编码区的结构特征分析

高等植物光系统Ⅱ反应中心蛋白Q_B的编码基因psbA,是一种重要的光调控基因,其控制光效表达的DNA单元是位于5′-上游的启动子区域。该基因的启动区结构虽然同大肠杆菌的十分类似,都具有一个“-10”元件和一个“-35”元件,但最近在有些植物中也观察到,在这两个元件之间还有一个类似真核“TATA”盒的保守序列。     

一个新的元件(NIRS)参与白介素2受体α 基因的调控

为研究白细胞介素2受体α亚基（IL－2Rα）基因中与负调控元件NRE（－391／－381bp）呈反向重复的序列NIRS（－153／－143bp）在该基因表达中的作用,通过检测Jurkat细胞及HeLa细胞中荧光素酶报告基因活性,发现NIRS与NRE不仅共同阻遏IL－2Rα基因的组成性表达,还共同参与介导RHA对该基因启动子的诱导活性。EMSA检测显示,激活前后的Jurkat细胞及HeLa细胞中均含有双链NIRS和双链NRE的结合蛋白;HeLa细胞中还含有与这两个序列结合的单链结合蛋白;但是,激活前后的Jurkat细胞抽提物分别加入HeLa细胞抽提物与单链DNA的结合体系中均能产生超迁移现象,其中活化细胞抽提物呈现较强的迁移结合带,紫外交联实验检测发现,在激活前后的Jurkat细胞和HeLa细胞中均存在双链DNA结合蛋白p83。结果显示,不同细胞中,反式作用因子能通过NRE和／或NIRS元件以及单、双链DNA的选择性对IL－2Rα基因启动子活性起关键调控作用。     

环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)参与人hsp90β基因的热诱导表达

为研究cAMP应答元件（CRE）在人热休克蛋白hsp90β基因表达中的作用,构建了数个受hsp90β基因不同长度调控片段介导的氯毒素乙酰基转移酶（CAT）报告基因质粒。分别转染Jurkat细胞并检测42℃1h热诱导前后CAT活性。结果发现删除hsp90β基因上游含CRE片段（－173／－91bp)后,CAT的热诱导表达活性降低了67％。电泳迁移率变更分析（EMSA）显示热休克后Jurkat细胞的核抽提物中磷酸化的CREB与该片段呈特异性结合。Western印迹实验及PKA活性检测发现CREB的磷酸化程度及PKA活性均随热诱导时间的延长而增加。以上结果表明：磷酸化的CREB通过与hsp90β基因上游的CRE结合参与该基因的热诱导表达,并可能与PKA传导途径有关。     

一个新的元件(NIRS)参与白介素2受体 a 基因的调控

为研究白细胞介素2受体a亚基(IL-2Ra)基因中与负调控元件NRE (-391/-381 bp)呈反向重复的序列NIRS (-153/-143 bp)中, 在该基因表达中的作用, 通过检测Jurkat细胞及HeLa细胞中荧光素酶报告基因活性发现, NIRS与NRE不仅共同阻遏IL-2Ra基因的组成性表达, 还共同参与介导PHA对该基因启动子的诱导活性. EMSA检测显示, 激活前后的Jurkat细胞及HeLa细胞中均含有双链NIRS和双链NRE的结合蛋白; HeLa细胞中还含有与这两个序列结合的单链结合蛋白; 但是, 激活前后的Jurkat细胞抽提物分别加入HeLa细胞抽提物与单链DNA的结合体系中均能产生超迁移现象, 其中活化细胞抽提物呈现较强的迁移结合带. 紫外交联实验检测发现, 在激活前后的Jurkat细胞和HeLa细胞中均存在双链DNA结合蛋白p83. 结果显示, 不同细胞中, 反式作用因子能通过NRE和/或NIRS元件以及单、双链DNA的选择性对IL-2Ra 基因启动子活性起关键调控作用.     

嗜盐菌XZ515 中类BR 蛋白基因部分片段的序列研究

在一个新嗜盐菌Ｈ．ｓｐ．ＸＺ５１５吧,编码自螺旋Ｃ至螺旋Ｇ的视黄醛蛋白基因片段已扩增并测定了此基因片段的核苷酸序列,翻译出的氨基酸排列次序与菌紫质蛋白和ａｒ－１,ａｒ－２相应蛋白的相应片段进行了比较,结果说明,在ｂｒ蛋白中,对于完成质子泵功能和视黄酝酿结合为关键性的氨基酸残基均为保守的。在ｂｒ蛋白中,Ｍ１４５可能对于视黄醛异构化反应是重要的残基。     

核蛋白因子与水稻蜡质基因5′端上游顺序的结合

近来,植物基因转录调控的研究借鉴了动物和酵母系统中采用的方法取得了一定进展。如依赖光表达的豌豆rbcS-3A基因,大豆种子发育特异的β-副球蛋白基因和水稻对脱落酸反应的rab基因,在它们表达的那些细胞的核蛋白抽提液中都找到了与其上游顺序特异结     

水稻mRNA多聚腺苷化信号位点的序列分析

大部分真核生物mRNA的加工涉及到mRNA前体的分裂/多聚腺苷化, 在3′-末端形成多聚腺苷酸(poly(A))尾巴. 为了研究水稻mRNA前体多聚腺苷化过程所必需的poly(A)加尾信号、下游调控元件和poly(A)位点等序列的特点, 用3′-末端带有poly(A) 的EST与全长cDNA序列进行比较, 建立了一个来自9953个基因的、覆盖12969条poly(A)位点两侧各40碱基序列的数据库. 结果发现, 只有7.9%的mRNA使用AAUAAA作为加尾信号, 超过60%使用AAUAAA的1~2个碱基变化的序列作为加尾信号, 11.5%的mRNA使用AAUGAA及其单碱基变化的加尾信号. 在约25%的mRNA的3′-末端存在多个poly(A)位点. 在90%的mRNA前体的加尾信号下游都能检测到富含U/GU的调控元件, 尤其在以AAUAAA的多碱基变化序列作为加尾信号的mRNA前体中, 半数以上都能在poly(A)位点两侧检测到下游调控元件. 而且, 这些调控元件的位置对poly(A)位点的选择有限制作用. 总之, 虽然水稻mRNA加尾信号的保守性较低, 但大量下游调控元件的存在保证了多聚腺苷化过程的正常进行.