抗HBsAg单链Fab抗体基因酵母表达载体的构建

采用重叠PCR技术 ,以抗乙肝表面抗原 (HBsAg)IgG铰链区基因为Linker将Fab抗体基因的重链和轻链连接起来 ,构成单链Fab基因。通过测序鉴定 ,克隆的单链Fab基因与理论上的完全一致 ,并成功构建含完整单链Fab基因的毕赤酵母 (P pastoris)表达载体。     

抗汉滩病毒单抗3G1 scFv植物表达载体的构建

利用PCR方法，从含有3G1 scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因，并使基因两端携带合适的限制性酶切位点．将其克隆人植物表达载体pBI121，构建获得3G1 scFv-pBI121重组质粒．酶切鉴定及测序结果均证明重组质粒构建成功，将重组植物表达载体转入农杆菌LBA4404，为进一步构建转基因植物的研究奠定了基础．     

抗汉坦病毒单链抗体双元载体的构建

利用PCR方法,从含有1A8 scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因,并使基因两端携带合适的限制性酶切位点。经多步连接将其克隆入植物表达载体pBI121或pCAMBIA1305．2。酶切结果证明1A8 scFv基因被成功克隆入植物表达载体pBI121及pCAMBIA1305．2,构建获得1A8 scFv-p BI121及1A8 scFv pCAMBI A1305．2重组质粒,并将其转入农杆菌GV3101。抗汉坦病毒mAb 1A 8scFv植物双元表达载体的获得,为进一步在植物中表达该抗体片段奠定了基础。     

抗SARS-CoV人源Fab抗体的表达及鉴定

为进一步研究抗SARS-CoV刺突蛋白S(Spike)的中和抗体2g7,对其进行了原核表达,将2g7转入琥珀突变的非抑制性菌株(SupE-)的大肠杆菌Top10F'中进行可溶性表达。用HPLC纯化后,SDA-PAGE显示2g7的轻重链均存在,ELISA,Westernblot检测显示2g7能与SARS-CoV的S1蛋白结合。BIAcore测定其与抗原的亲和力为2.67×10-8mol。竞争ELISA显示该抗体能与SARS-CoV刺突蛋白S(Spike)结合并阻断该蛋白与其受体ACE2的结合。实验结果表明:利用免疫噬菌体抗体库能在小库容的情况下筛选获得高亲和性的人源抗体,并可以在大肠杆菌中获得高效表达,这一实验结果为有效性地防治病毒性疾病提供了思路。     

重组人源性抗HBsAg Fab抗体的特性分析

通过噬菌体展示技术从含高滴度抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体的人外周血淋巴细胞获得抗HBsAg Fab抗体的轻、重链基因．将Fab的轻、重链基因分别整合到巴斯德毕赤酵母(Pichua pastons)GS115菌株的染色体上,成功构建了高效分泌表达抗HBsAg Fab抗体的酵母工程菌．对酵母表达的重组Fab抗体进行了纯化,并对其相对分子质量、糖基化以及抗原结合能力等特性进行了分析,结果显示重组酵母分泌表达的重组人源性抗HBsAg Fab是一个相对分子质量为50000左右的低糖基化糖蛋白,1mg重组Fab抗体相当于40u的抗乙肝表面抗原抗体(20U／mg)．表明重组Fab抗体具有较强的结合HBsAg的能力．     

人角质细胞生长因子的植物表达载体构建

人角质细胞生长因子(KGF)有3个外显子,2个内含子.以人DNA为模板,PCR扩增获得角质细胞生长因子外显子2和外显子3;合成单链的寡核苷酸,经链延伸和PCR扩增从而获得外显子1.应用延伸PCR将3个外显子连接得KGF编码序列,并连接CaMV35S启动子和NOS终止子后克隆至植物表达质粒pBI 1301.     

乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建

报道了将乙型肝炎病毒（ａｄｗ亚型）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因和ＨＢＡｇ及其前导序列（ＨＢｓＡｇ＋ｐｒｅＳ２）基因分别插入植物表达载体ｐＲｏＫⅡ的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子下游,构建为重组质粒ｐＲＨＢ和ｐＲＰ,并将其分别导入农杆菌ＬＢＡ４４０４中。     

番茄SlIWS1基因植物表达载体构建与瞬时表达

番茄是广泛种植的果蔬类作物,病害发生是导致番茄产量和品质降低的重要原因,AtIWS1 (Arabidopsis thaliana interact with SPT6)基因可以提高拟南芥抗病性.文章通过病原菌接种克隆番茄SlIWS1基因,并构建植物表达载体,利用农杆菌介导方法在烟草叶片中进行瞬时表达和Western B...     

植物表达抗体的研究进展

利用转基因植物生产抗体是一个新兴的生物技术领域。这种技术将编码全抗体或抗体片段的基因导入植物，从而在植物中产生全抗体或抗体片段，获得的抗体能功能性地识别抗原并结合抗原。目前已有农杆菌介导转移法和基因枪法等多种转化技术用于将抗体基因导入植物细胞。利用植物表达抗体的一大优势是能大规模廉价生产免疫治疗用抗体。此外，植物抗体也可用于植物自身抗病，并能调节植物细胞代谢。本文主要就植物生产抗体的方法、抗体的表达及应用作一综述。     

人β-防御素-2植物表达载体的构建

用重组基因 (hBD 2 )替换双元载体 pCAMBIA130 4中的GUS GFP基因 ,构建成植物表达载体pCAMBIA130 4 hBD2 ,并经过了酶切、PCR和序列分析验证 .该载体的构建可为培育转基因抗病植物和利用生物反应器生产防御素奠定基础 .     

酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建

以从原核表达载体中酶切得到的tps1基因为模板，设计适当的引物，利用PCR技术，克隆出核苷酸数大约1.5k的片段，PCR产物经回收后，与PCAMBIAI303载体连接并转化大肠杆菌DH5a，阳性重组子经PCR鉴定，结果表明已获得海藻糖磷酸合成酶基因的植物表达载体。     

含多种抗真菌病基因植物表达载体的构建

含有大麦核糖体失活蛋白（ＢＲＩＰ） 编码序列的质粒ｐＲＣ２４／ＢＲＩＰ改造后, 依次与含有水稻碱性几丁质酶基因ＲＣＨ１０ 和水稻酸性几丁质酶基因ＲＡＣ２２ 编码序列的质粒ｐＡＢＣ２ 以及含有苜蓿β１ , ３葡聚糖酶编码序列的质粒ｐＡＡＧ８９ 连接, 得到了中间载体ｐＲＡＳ１０ ．ｐＲＡＳ１０再与根癌农杆菌双元载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ 连接, 得到了适合水稻转化的双元载体ｐＲＡＳ１３００ ． 利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４ 中, 并准备将ｐＲＡＳ１３００ 转入水稻, 以期获得对真菌病有广泛且较强抗性的水稻品种     

绿豆防御素基因的克隆、序列分析和植物表达载体的构建

从绿豆叶片提取总DNA中,通过PCR方法扩增出362bp的具有多种抗病、抗虫特性的绿豆防御素基因, 并将其克隆到pGM-T easy vector,酶切图谱及DNA 测序分析表明克隆的片段包含了完整的绿豆防御素基因的编码序列,与原序列同源性达到99.5%,蛋白质同源性达到100%.此基因编码的多肽由73个氨基酸组成,含有28个氨基酸的信号肽和8个半胱氨酸,可形成4个二硫键.我们用此基因构建了高效植物表达载体pBin438-LD.     

小鼠Znf230基因启动子与LacZ报告基因融合载体的构建及其在细胞中的表达

国家自然科学基金(303714919040802530500186)     

异戊烯基转移酶基因克隆及植物表达载体构建

根据已知的异戊烯基转移酶基因保守序列设计引物,以根癌农杆菌C58的Ti质粒为模板,采用PCR方法扩增获得了异戊烯基转移酶基因723bp的片段.将该片段回收,连接到pMD18-T载体测序,测序片段经酶切回收后克隆到植物表达载体pBI121中,转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α.将阳性质粒转化农杆菌感受态细胞EHA105,经菌液和质粒PCR分析,获得了真核表达载体pBI121-ipt,这为异戊烯基转移酶基因功能的进一步研究提供了基础.     

苜蓿花叶病毒复制酶基因全长cDNA植物表达载体的构建

将苜蓿花叶病毒中国分离株（Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，AlMV-Ch）的复制酶P2亚基（90KD蛋白）基因的全长cDNA构建到植物表达载体pROK Ⅱ中，得到重组植物表达载体pAlMV-FL．