人肿瘤坏死因子受体Ⅰ（hTNFR Ⅰ）基因死亡域在大肠杆菌中？…

将人肿瘤坏死因子受体Ⅰ（ｈＴＮＦＲＩ）死亡域基因克隆在氯霉素乙酰转移酶的后面，构建成重组表达质粒ｐＬＴ１０ＣＡＴＬＤｄ。该融合蛋白基因转化大肠杆菌后发酵。ＩＰＴＧ诱导２ｈ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定ＣＡＴＬＤｄ蛋白质的分子质量为３９ｋｕ，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹实验进一步作了鉴定。     

重组人肿瘤坏死因子蛋白TNF-α的纯化与功能鉴定

 串联亲和纯化系统（TAP）是近年来广泛使用的一种可在接近于生理条件下探究蛋白间相互作用的生化纯化方法。目前许多关于TAP 的研究报道均使用细胞内转录因子为目标蛋白,探索细胞内与其相互作用的蛋白分子。本文尝试建立一种细胞外配体-受体刺激介导的信号转导初始复合体的纯化体系,为此选择了一种多功能的免疫分子配体蛋白--肿瘤坏死因子蛋白超家族（TNFSF）中的核心成员TNF-α。TNF-α 是一个强效促炎因子,可介导炎症反应、细胞凋亡和激活等生理效应,是至今研究最多的TNFSF 成员。利用原核表达系统纯化出了一种带有多个标签的重组人源TNF-α 蛋白,通过检测其受体下游信号通路鉴定该蛋白与天然TNF-α 蛋白的生理活性相似,从而证明该蛋白可以用于胞外TAP 系统探究TNFR 下游信号通路,为配体-受体刺激介导的信号转导初始复合体的胞外串联亲和纯化系统的建立奠定了基础。     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白生物仿制药对大鼠类风湿性关节炎的治疗作用

目的:评价重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)生物仿制药对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用.方法:将大鼠随机分成6组:阴性对照组(生理盐水)、阳性药物组(Enbrel)和TNFR-Fc高、中、低质量分数组,空白组(无炎症),每组6只,弗氏完全佐剂(CFA)建立类风湿性关节炎模型.给药13 d后,分别测量大鼠体重、后足足垫厚度,关节炎指数评分,ELISA法测量细胞因子水平.结果:与阴性对照组相比,Enbrel组和TNFR-Fc大、中、小质量分数组的大鼠体质量明显增加(P0.05)、继发性足肿胀减弱(P0.05)、关节炎评分分值、IL-1β、TNF-α、IL-6含量均减小(P0.05),IL-10含量升高(P0.05).结论:TNFR-Fc通过降低炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平以及升高IL-10水平来发挥治疗类风湿性关节炎的作用.     

人肿瘤坏死因子受体Ⅰ(hTNFRⅠ)基因死亡域在大肠杆菌中的表达

将人肿瘤坏死因子受体Ⅰ（ｈＴＮＦＲＩ）死亡域基因克隆在氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）的后面,构建成重组表达质粒ｐＬＴ１０ ＣＡＴＬＤｄ．该融合蛋白基因转化大肠杆菌后发酵,ＩＰＴＧ诱导２ ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定ＣＡＴＬＤｄ 蛋白质的分子质量为３９ ｋｕ．Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹实验进一步作了鉴定．表达产物为包涵体．ＣＡＴＬＤｄ 蛋白质经Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 柱层析后纯度大于９５％ ．     

人RANKL胞外结构域原核表达载体的构建及表达条件优化

细胞核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of the NF-κB ligand,RANKL)是TNF超家族的重要成员之一,属于Ⅱ型跨膜蛋白,通过与其受体核因子κB受体活化因子(RANK)构建的信号通路参与乳腺癌的发生、肿瘤骨转移、骨质疏松、关节炎等病理过程。人RANKL胞外结构域基因片段与原核表达载体pET-21b融合并转化至表达菌Rosetta,并对其表达条件进行了优化。通过对诱导时机,诱导温度,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度,诱导时间及甘油浓度的条件优化表明,当IPTG的浓度为0.2 mmol/mL,20℃振荡诱导培养6 h时,甘油浓度为4%时,可在上清中获得高效表达的pET-21bRANKL融合蛋白,为该蛋白的进一步纯化及结构与功能研究打下了良好的基础。     

58型人乳头瘤病毒E7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

 为获得抗58型人乳头瘤病毒(HPV58)E7蛋白的单克隆抗体,乳糖诱导重组工程菌表达HPV58 E7融合蛋白,以纯化后的该重组蛋白为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到6株分泌抗HPV58 E7单克隆抗体(McAb)的工程细胞株,并采用体内接种方法及亲和柱层析纯化技术制备6株抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western-blot实验和细胞免疫荧光检测结果表明,所得抗体均为IgG2a类,κ型,抗体效价均可达10^-5,并且能够与原核及真核系统表达的HPV58 E7蛋白发生特异性抗原-抗体反应.该抗体的成功制备为后续HPV58 E7致癌生物学研究及相关肿瘤诊断试剂的开发奠定基础.     

表达EGFR与HER2双抗体融合蛋白腺病毒载体研究

构建携带Cetuximab全长抗体与Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)融合蛋白的腺病毒,探讨其在体外表达情况,及其与EGFR和HER2的结合能力.通过PCR,将抗体cetuximab基因与编码Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)的序列融合,构建携带西妥昔单抗全长基因与Herin融合基因的腺病毒穿梭载体pDC339-AT2一Herin,并在293细胞内包装成重组病毒Ad5-AT2-Herin.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Ad5-AT2-Herin表达全长抗体融合蛋白的体外表达量;应用Western印迹法检测所表达全长抗体轻重链的完整性及均衡性;应用间接免疫荧光法(IFA)检测所表达的融合蛋白与EGFR(+)Her2(-)的A431细胞,以及EGFR(-)Her2(+)的SK-OV-3细胞膜结合的特异性.ELISA检测分析表明,AdS-AT2-Herin在293细胞中的表达量为209.3 ng/mL-317.3 ng/mL;Western blot显示轻重链表达平衡,大小符合预期;间接免疫荧光(IFA)显示腺病毒表达的融合蛋白与A431细胞表面受体EGFR及SK-OV-3细胞表面受体Her2均能特异性结合.成功构建携带EGFR和HER2双特异性抗体基因的腺病毒载体Ad5-AT2-Herin,该载体在体外能高效表达双特异性抗体蛋白AT2-Herin,而且AT2-Herin蛋白能在体外与EGFR和HER2特异结合.     

家鸡生长激素释放激素受体(GHRHR)的蛋白表达与抗体制备

本研究采用RT-PCR等方法,构建编码家鸡两个GHRH受体(GHRHR1和GHRHR2)N-末端胞外结构域的原核表达载体,并在细菌中成功诱导其表达.利用离子亲和层析技术,纯化两受体的重组蛋白片段.在此基础上,利用重组蛋白在兔中制备了两受体的抗体,采用Western blot方法,初步验证这些抗体对垂体以及HEK293细胞中表达的家鸡GHRHR1和GHRHR2识别的有效性.     

重组融合蛋白GST-SLT-ⅡeB表达条件的研究

通过在不同温度、不同诱导时间、不同异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）诱导浓度条件下,对重组大肠杆菌PPSLT-ⅡeB表达的谷胱甘肽S转移酶（GST）与类志贺氏菌毒素Ⅱ型变异体B亚单位（SLT-ⅡeB）的融合蛋白（GST-SLT-ⅡeB）的分析,结果表明在所试条件中,温度是影响表达的主要因素,重组大肠杆菌（PPSLT-ⅡeB）在28℃温度条件下,可以明显表达融合蛋白GST-SLT-ⅡeB. 在IPTG为1mmol     

表达EGFR与HER2双特异性抗体融合蛋白腺病毒载体的构建及表达

目的：构建携带Cetuximab全长抗体与Herstatin C末端79个氨基酸（Herin）融合蛋白的腺病毒,探讨其在体外表达情况,及其与EGFR和HER2的结合能力。方法：通过合拉PCR,将抗体cetuximab基因与编码Herstatin C末端79个氨基酸（Herin）的序列融合,构建携带西妥昔单抗全长基因与Herin融合基因的腺病毒穿梭载体pDC339-AT2-Herin,并在293细胞内包装成重组病毒Ad5-AT2-Herin。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测Ad5-AT2-Herin表达全长抗体融合蛋白的体外表达量;应用Western印迹法检测所表达全长抗体轻重链的完整性及均衡性;应用间接免疫荧光法（IFA）检测所表达的融合蛋白与EGFR( )Her2(-)的A431细胞,以及EGFR(-)Her2( )的SK-OV-3细胞膜结合的特异性。结果：ELISA检测分析表明,Ad5-AT2-Herin在293细胞中的表达量为209.3 ng/ml-317.3 ng/ml;Western blot显示轻重链表达平衡,大小符合预期;间接免疫荧光(IFA)显示腺病毒表达的融合蛋白与A431细胞表面受体EGFR及SK-OV-3细胞表面受体Her2均能特异性结合。 结论：成功构建携带EGFR和HER2双特异性抗体基因的腺病毒载体Ad5-AT2-Herin,该载体在体外能高效表达双特异性抗体蛋白AT2-HERIN,而且AT2-HERIN蛋白能在体外与EGFR和HER2特异结合。     

果蝇血液发育基因Nfat的多克隆抗体的制备

Nfat基因在血液发育中具有重要作用.根据已报道的Nfat基因序列,以果蝇胚胎cDNA为模板,通过PCR扩增Nfat部分编码序列,并将其连接到pET-28A原核表达载体上,经过双酶切以及测序鉴定成功后,将重组质粒转化E.coli BL2l.在37℃时,通过IPTG诱导表达融合蛋白,通过尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,然后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blotting检测抗体的效价以及特异性.结果表明,获得的Nfat多克隆抗体特异性较强,为后期Nfat基因的研究工作奠定了基础.     

磁性载体蛋白抗体阻断剂制备及性能测定

为了有效去除血清中的白喉毒素跨膜结构域抗体,提高检测的精准度,建立四氧化三铁纳米磁珠共价偶联载体蛋白对血清中载体蛋白抗体的去除方法,并评估去除效果;采用高温多元醇合成法制备表面包裹葡聚糖的四氧化三铁纳米颗粒,利用溴化氰将葡聚糖分子上的羟基活化为亚氨基碳酸酯,并与白喉毒素跨膜结构域通过氨基共价偶联,制得纳米磁珠-白喉毒素跨膜结构域抗体阻断剂;纳米磁珠-白喉毒素跨膜结构域抗体阻断剂与免疫过白喉毒素跨膜结构域-血管内皮生长因子或白喉毒素跨膜结构域-肿瘤坏死因子融合蛋白疫苗的小鼠抗血清进行孵育,以吸附去除白喉毒素跨膜结构域特异性抗体;对孵育前、后的抗血清进行酶联免疫吸附测定。结果表明:白喉毒素跨膜结构域抗体的去除率高达90%以上,检测精准度显著提高;在37℃条件下,仅需孵育1 h即可充分去除血清中的白喉毒素跨膜结构域抗体。     

卵形鲳鲹TNFSF6的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备

为了研究卵形鲳鲹肿瘤坏死因子配体6(TNFSF6)的功能,本研究构建了TNFSF6的原核表达载体并制备了其多克隆抗体,首先通过PCR扩增技术扩增获得了TroTNFSF6的开放阅读框序列,并构建了原核表达重组质粒pET-TroTNFSF6,随后将重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21中,进行原核表达并获得重组蛋白rTroTNFSF6.结果显示,重组蛋白rTroTNFSF6大小约46.5 kDa,其最适诱导温度为20℃,诱导时间为8 h,IPTG的最佳浓度为0.6 mmol/L.可溶性分析表明,重组蛋白rTroTNFSF6主要在沉淀中,以包涵体的形式存在.将纯化后的重组蛋白rTroTNFSF6免疫小鼠以制备多克隆抗体,ELISA检测结果表明其效价高达1∶32 000.本研究为进一步探究卵形鲳鲹TNFSF6的功能奠定了基础.     

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.     

毕赤酵母表达Neuritin蛋白的纯化及鉴定

为研究重组Neuritin的毕赤酵母表达蛋白的纯化方法及鉴定。应用甲醇诱导GSll5/pPIC9K-Neuritin毕赤酵母工程菌株表达Neuritin蛋白,采用硫酸铵盐析、His-Trap Crud亲和层析等方法,对该表达产物进行纯化。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE、western-blot和生物质谱鉴定。结果显示,SDS-PAGE分析显示经甲醇诱导后表达的蛋白获得了与Neuritin分子量理论值相符的条带,western-blot分析它能够与抗表位抗体特异反应,进一步生物质谱分析证实该纯化重组蛋白为Neuritin重组蛋白。由此可知,本研究建立了一种有效的纯化方法,获得高纯度的Neuritin重组蛋白,为大量制备Neuritin纯化蛋白,开展其功能和机制研究奠定基础。     

抗栓胰岛素原钙调素重组融合蛋白表达条件的摸索

以无活性人胰岛素原突变体为分子支架,在C肽位置嵌合特异拮抗血小板GPⅡbⅢa受体的去整合素活性结构位点序列,构建嵌合人胰岛素原突变体.该突变体相对分子质量大小为7.0×103,与钙调素的C末端融合后形成新型重组融合蛋白质,相对分子质量为24.7×103.构建该重组融合蛋白质的大肠杆菌BL21(DE3)表达系统,尝试在大肠杆菌表达体系中,对该重组融合蛋白质进行高效表达.结果表明,该重组融合蛋白质的表达率约占菌体全蛋白的30%,优化后的表达条件为25℃,50μmol.L-1诱导表达16 h.     

Ⅱ型猪圆环病毒ORP2基因的原核表达与初步应用

Ⅱ型猪圆环病毒（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的重要病原．本研究用PCR以构建的PCV2 ORF2重组质粒pBS-T-ORP2为模板，扩增截短的ORP2（tORF2）基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3，构建重组表达质粒pGEX-tORP2并转化大肠杆菌BL21（DE3）．经SDS-PAGE及Western blot鉴定，成功表达了谷胱甘肽S转移酶（GST）融合的tORP2，重组蛋白分子量约为45ku，表达量约为菌体总蛋白的20％，重组蛋白具有良好的免疫学活性．用tORP2重组蛋白对20份临床猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）阳性猪血清进行Western blot检测，有4份（20％）血清显示PCV2抗体阳性，说明PCV2与PRRSV存在共同感染现象．本研究初步证明表达的tORV2重组融合蛋白可以应用于临床检测．     

对BIV—Gag和Env抗原特异性抗体的免疫检测

本文用高效表达载体表达出的融合ＢＩＶ核心蛋白和外膜蛋白作为Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测的抗原，分别对Ⅰ，Ⅱ两口岸进口奶牛及后代进行了流行病学调查，发现用外膜蛋白检测阳性率比核心蛋白阳性率高，进一步的追踪调查表明核心蛋白的抗体水平在减弱的同时外膜蛋白的抗体有加强的趋势。     

绿色荧光蛋白α2b-干扰素融合蛋白的表达与活性研究

采用基因重组技术,构建原核表达质粒pET 32a( )/GFP-α2b-IFN,转化大肠杆菌BL 21,以IPTG诱导融合蛋白的表达并用镍金属螯合层析柱进行纯化.SDS-PAGE及免疫印迹结果显示,46.0 kD的融合蛋白在大肠杆菌中得到了正确的表达,并具有α2b-IFN的抗原活性.受体结合实验表明,该融合蛋白能够与W ISH细胞上的干扰素受体特异性结合,并在激发光下呈亮绿色荧光.采用细胞病变法测定分离纯化的融合蛋白的抗病毒活性,比活力为1.0×107IU/m g.表达的GFP-α2b-IFN融合蛋白具有α2b-IFN的特性与荧光活性,为研究α2b-IFN受体功能以及IFN与细胞相互作用的机理奠定了基础.     

烟草花叶病毒单克隆抗体的制备和鉴定

经工程菌表达与纯化,得到了纯度95%以上的TMV-CP-F重组蛋白,配合提取的TMV天然病毒颗粒作为免疫原.通过杂交瘤技术获得了14株能分泌特异针对TMV外壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株.经鉴定14株细胞所分泌的抗体亚类为IgG1型,抗体轻链均为κ型.经ProteinA一步法亲和层析纯化所得抗体经鉴定相对分子质量在149.36～157.23 ku之间,抗体纯度在80%以上.经间接ELISA测定,14株抗体均与TMV-CP重组蛋白和TMV病毒有良好特异性反应.所制备的抗TMV抗体的特异性高,可用于与其相关的免疫检测研究和应用.