胡萝卜lea基因cDNA片段的克隆及其表达特性分析

在MS培养基中加入高浓度的蔗糖 ,可使胡萝卜体细胞胚的发育静止于子叶胚阶段 ,而当蔗糖浓度恢复到正常水平时 ,静止的体细胞胚便转入胚后发育 .采用RT_PCR的方法 ,从调控状态的胡萝卜体细胞胚中获得lea基因Dc3家族一个新成员的cDNA片段 .Northern杂交结果表明 ,该基因在调控状态的胡萝卜体细胞胚中具有强表达活性 ;在解调控 1 2h的胡萝卜体细胞胚中 ,表达活性明显降低 ;解调控 2 4h之后 ,其表达活性则基本消失 .由此及相关结果推测 ,通过改变培养基中的蔗糖浓度 ,可以使悬浮培养的胡萝卜体细胞胚胎重现类似于天然种子休眠与萌发的发育过程 .     

一种胡萝卜蔗糖转运蛋白基因家族新成员的分离及功能鉴定

培养基中蔗糖浓度的变化可以调控胡萝卜体细胞胚根的发育进程。为了分析在此过程中蔗糖的转运与体细胞胚根发育的相关性。利用RT－PCR获得胡萝卜蔗糖转运蛋白基因的探针,筛选蔗糖调控状态下的胡萝卜体细胞胚的cDNA文库,分离到蔗糖转运蛋白基因家族的一个新成员的全长cDNA,命名cSUT基因(GenBank注册号为AB036758）。对该基因的编码蛋白进行结构分析表明,其具有典型的12个跨膜结构域。在酵母中的表达分析证明,cSUT基因的编码蛋白有转运蔗糖的功能,转运活性受pH值影响较大,Km为9mmol/L,且对蔗糖的运输具有专一性,Northern杂交结果显示其主要在根部表达,且在蔗糖调控与解调控的胡卜体细胞胚发育的不同时相存在显著表达差异,推测cSUT基因与蔗糖的信号转导以及胚根的发育密切相关。     

采用调控培养方法提高胡萝卜体细胞胚活力的研究

自从开创人工种子研制以来,就一直存在若干研究难题,如人工种皮材料的寻找与研制,种子播种时抗微生物的侵染以及人工种子的贮藏等,至今尚未得到满意的解决,就人工种子的植物体细胞胚而言,提高胚的活力是获得高质量的人工种子的基础,也是克服有关难题的重要条件。在体细胞胚培养的研究中,曾期望通过ABA及简单的干燥脱水处理,使胚达到静止状态,有的作者也试验过利用提高蔗糖、麦芽糖和铵离子浓度达到静止状态,但均未获得理想的效果。我们用调控培养方法获得了具高活力的静止状态的胡萝卜体细胞胚,这一结果在     

alc基因开关系统在水稻中的建立和优化

对以构巢曲霉的alc调控元件为基础构建的酒精诱导系统（alc系统）可在转基因水稻中调控GUS编码基因的表达进行了详细研究。结果表明。在转基因水稻中，非诱导状态下alc系统控制下的报告基因没有表达；通过根部浇灌方式施加酒精后则可诱导报告基因的表达,alc系统的表达活性依赖于酒精浓度：0.1%的酒精不能诱导alc系统，而0.5%的酒精可使GUS活性提高大约70倍。2%的酒精浓度下alc系统的表达活性最高，是诱导前的120倍左右；并且这些浓度的酒精对水稻均未观察到生理毒害作用。酶动力学研究表明，诱导48h后，GUS编码基因开始表达；96h后，GUS活性达到最高，可达诱导前的130倍左右。120h后GUS活性开始降低，对诱导前后的叶片进行组织化学染色检测，结果也证实alc系统可以严谨地控制外源基因在水稻中的表达。     

山羊 β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β－酪蛋白基因启动区５′端上游调控序列和外显子１,２及内含子１在内的乳腺表达载体,并与人血清白蛋白（ｈＡＬＢ）小基因（含全长ｃＤＮＡ序列及其内含子１）构建成融合基因,鼠尾静脉注射实验表明,该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达,应用显微注射方法交该融合基因导入小鼠受精卵,并将受精卵移植于假孕母鼠,共获得３３只Ｆ０代小鼠,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实,有８只小鼠基因组中整合有ｈＡＬ     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离及其启动子功能分析

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

C3—C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶P—蛋白亚基上游调控序列在转基因水稻中的表达

将C3-C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶(GDC)P-蛋白亚基基因(gdcsP)的上游调控序列与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因编码区以及CaMV终止子融合,构建植物表达载体.采用农杆菌介导方法转化水稻,并在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.结果表明,在水稻中gus嵌合基因特异地在木质部和韧皮部表达,在不同器官及组织中表达活性也有所差异,其中以根中最高,茎秆次之,叶再次,而在成熟胚乳中没有表达.在转基因水稻中,gdcsP启动子的表达也受水稻发育时期的调控,随植物组织成熟度的增加而降低.     

金鱼β-catenin以细胞自主性方式抑制神经发育早期调节基因vsx1的表达

β-catenin基因是脊椎动物背部中轴结构形成的必需基因. 近年的研究发现, 在斑马鱼和爪蟾中, β-catenin还具有抑制神经外胚层形成的作用. 为深入了解β-catenin是如何抑制神经外胚层形成以及这种抑制在正常发育过程中的功能, 我们研究了金鱼胚胎发育过程中β-catenin对神经外胚层发育早期调节基因vsx1表达的抑制作用. 实验结果表明, 用反义morpholino oligonuc- leotides (MO)抑制内源β-catenin的功能可导致胚胎发育早期vsx1的广泛表达; β-catenin可抑制vsx1基因启动子所控制的绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的表达. 进一步的分析证明, β-catenin所直接启动的下游靶基因boz可以通过vsx1基因启动子中的特定结合位点抑制vsx1基因启动子所控制的GFP报告基因的表达. 这些结果表明, β-catenin在脊索中胚层前体细胞中启动与脊索中胚层发育调节相关基因表达的同时, 还能以细胞自主性方式抑制神经发育早期调节基因vsx1在这些细胞中表达, 提示β-catenin在脊索中胚层前体细胞中抑制vsx1基因的异位表达与启动脊索中胚层调节基因的表达都是保障脊索正常发育所必需的     

植物的发育:从细胞到个体

随着分子生物学研究手段的丰富,植物发育生物学也从宏观的植物形态观察走向了微观的细胞和基因水平的研究.植物本身有着显著不同于动物的胚后发育特征,这种发育模式赋予了植物极其灵活的发育可塑性以应对不同的生长环境.在长期进化过程中,植物正是通过持续的调整发育来适应外界环境变化,造就了植物界丰富的多样性.本文以植物干细胞的功能和调控为核心,阐述了干细胞调控植物胚后发育的模式以及植物内源激素对干细胞和植物发育调控的贡献,讨论了内源的遗传信息和外部的环境因素在植物发育过程中的整合,以及这些因素如何调控农作物的器官和形态发育,继而影响到作物的产量.     

植物雄性不育的遗传机制探讨

本文评述了雄性不育性的遗传分类、细胞质育性因子、核质互作方式、环境调控、遗传操作等方面的研究进展，提出了解释雄性不育产生的双基因模型假说，认为控制雄性育性表达有二类核基因，一类是控制小孢子发生过程的基因（花粉发育结构基因），另一类是调控花纷发育结构基因表达条件的基因（调节基因），这二类基因任一发生突变均将产生遗传的雄性不育，细胞质（内环境）和生境（外环境）通过调控调节基因的表达成其产物，使得花纷发育结构基因表达所需条件不能满足而导致雄性不育．     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

胚胎发育基因表达的时-空模式

精子和卵子的结合启动了胚胎发育，其一系列变化过程中最引人注目的是：①卵母细胞结构与卵裂球命运间的关系；②卵裂球获得定位或修饰中细胞遗传及相互作用的重要性；③胚胎细胞中迟早出现决定状态的性质。胚胎发育是基因选择性的按一定的时-空顺序模式表达的过程，某个基因在特定阶段的表达和在表达时间上的相对稳定性对发育中的相应细胞生长分化起着非常关键的作用^[1，2]，基因表达的变化决定着整个生命过程。     

水分胁迫诱导表达的小麦基因的cDNA片段克隆和序列分析

以３０％（－１．３１ＭＰａ）ＰＥＧ－６０００对小麦幼苗进行重度水分胁迫处理,利用ｍＲＮＡ差异显示技术分离了水分胁迫诱导表达的小麦基因ｄｉｌｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ,ｄｉ１）的ｃＤＮＡ片段,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明,ｄｉ１基因在水分胁迫１０ｈ后表达开始增强并随着水分胁迫时间的延长而增强,水分胁迫４８ｈ时其表达最强。对ｄｉｌ基因的ｃＤＮＡ片段进行了克隆和序列测定（２１１ｂｐ）     

bcl-2基因在蛇毒诱导的血管内皮细胞凋亡中表达增加

通过去除培养液中生长因子和向培养液中加入响尾蛇毒两种方法诱导人脐带静脉血管内皮细胞发生凋亡中 用ｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ方法检测被片处理细胞的ｂｃｌ－２基因的表达,结果表明在正常２的细胞和用去除生长因子诱导亡垢细胞中未检测到ｂｃｌ－２基因的表达,而在１０μｇ／ｍｌ的蛇毒诱导细胞凋亡６ｈ后ｂｃｌ－２基因表达增加,并且其ｍＲＮＡ剪接为两条首次发现ｂｃｌ－２基因在蛇毒诱导的血管内皮细胞凋亡中表达增加和剪接     

通过mRNA差异显示分离一个新的斑马鱼胚胎发育基因

无脊椎动物果蝇形态发生分子机理被揭示之后,脊椎动物形态发生分子机理的研究成为发育生物学的研究焦点。作为脊柱动物研究模型的斑马鱼,其胚胎发育基因的分离无疑是进行该研究的入手点。分离斑马鱼胚胎发育基因有我种有效方法可供选择。本文用ｍＲＮＡ差异显示技术对斑马鱼受卵精后４,５和６ｈ的胚胎的ｍＲＮＡ进行了差异显著显示,对其中一个神经胚特异的ｃＤＮＡ的片段进行了克姓和序列分析,与Ｇｅｎｂａｎｋ中已有的基因序列     

植物幼小原胚的电激转化

用电激法将外源报告基因导入植物原胚获得瞬间表达．用酶解和显微解剖法分离出烟草含８～３２个细胞的幼小原胚与含２５０～４００个细胞的球形胚,导入ＧＵＳ和ＧＦＰ基因后,置于ＫＭ８ｐ培养基 １～２ｄ．当电场强度为 ５００～１５００ Ｖ／ｃｍ时,可检测到 ＧＵＳ蓝色反应和 ＧＦＰ绿色荧光,其中幼小原胚在电场强度为 ７５０ Ｖ／ｃｍ时,外源基因瞬间表达频率最高,为 ２．２％,球形胚在电场强度为１２５０ Ｖ／Ｃｍ时表达频率最高为 ５．９％．若以转化细胞占胚细胞总数的比例为有效转化频率,则幼小原胚的有效转化频率约为球形胚的７倍．     

海带和裙带菜组织培养的初步观察

高等植物体细胞发育的全能性,于50年代首先在胡萝卜根的韧皮部细胞见到。而高等植物从组织培养中长出完整植株的已履见不鲜。大型海藻的组织培养和体细胞发育全能性的研究目前做的很少。日本学者在海带的组织培养中应用激动素曾得到孢子体。我们实验室在这方面做了一些实验,应用新的人工合成的激素进行组织培养,取得了一些初步结果。这些实验表明,单个体细胞能长成完整的植株。本实验着重用藻体的切块(外植体)进行培养,在性质上是组织培养,由此观察到一些有关体细胞发育全能性的材料。     

斑马鱼Dpr2通过促进Nodal受体的降解而抑制中胚层诱导作用

转化生长因子β( TGFβ)家族的Nodal蛋白被认为是脊椎动物的关键内源中胚层诱导因子,Nodal信号的精确调控对于胚胎的正常发育是必需的。这里我们报导斑马鱼 dapper2 (dpr2)在早期胚胎发育过程中在中胚层前体细胞中表达,受 Nodal 信号的正调控。在斑马鱼活体胚胎中的研究表明,Dpr2抑制 Nod al信号的中胚层诱导活性。Dpr2定位在晚期溶酶体中,与 TGFβ受体 ALK5 和ALK4结合,加速这些受体在溶酶体中降解。[Science ,2004, 306(5693) :114-117]斑马鱼Dpr2通过促进Nodal受体的降解而抑制中胚层诱导作用@张丽霞$清华大学生物膜与膜生…     

体细胞克隆中核的重编程

尽管体细胞克隆在绵羊、牛、小鼠、猪、山羊、兔、猫、大鼠和骡子等物种中都获得了成功, 但却未能得到狗和猕猴的克隆个体, 而且克隆效率非常低. 克隆效率低使体细胞克隆技术在科研和生物技术等方面的应用受到限制. 供体核移入去核的卵细胞后, 必须经过表观遗传修饰的重编程, 回到胚胎开始发育的全能状态. 目前认为: 供体核的不完全重编程是导致克隆效率低的主要原因. 本文从DNA甲基化、组蛋白乙酰化、X染色体失活、端粒、印记基因以及其他发育相关基因的表达几个方面来探讨影响克隆效率的因素.     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.