pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射抗肿瘤效应的实验研究

目的研究pEgr-Endostatin辐射诱导肿瘤的表达特性及其抗肿瘤作用,为提高临床肿瘤放疗疗效提供实验证据.方法 Western blotting法检测pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射诱导黑色素瘤B16细胞蛋白表达;建立动物模型,用ELISA法检测不同处理组Endostatin的剂量水平,比较不同处理方式的差异.结果 Western blotting法检测结果显示:重组质粒转染的黑色素瘤B16细胞上清中均有Endostatin蛋白表达,而未转染重组质粒的B16细胞和转染空质粒的B16细胞上清中未见Endostatin蛋白表达.ELISA法检测结果表明:体外接受2~10 Gy X射线照射,Endostatin表达水平明显增加,且照射剂量为4 Gy时Endostatin的表达水平最高.2 Gy照射8~72 h后,Endostatin表达水平与假照射组比较明显增加,在48 h时Endostatin表达水平最高.动物实验表明:荷瘤+25 Gy照射组、荷瘤+pEgr-Endostatin照射组、荷瘤+pc DNA3.1+25 Gy照射组和荷瘤+pEgr-Endostatin+25Gy照射组肿瘤生长率显著低于单纯荷瘤组(P0.05#0.01),荷瘤+pEgr-Endostatin+25 Gy照射组亦明显低于荷瘤+25 Gy照射组和荷瘤+pEgr-Endostatin组(P0.05#0.01).结论 pEgr-Endostatin重组质粒联合电离辐射能使Endostatin蛋白表达增加,从而抑制血管内皮细胞生长、发挥抗肿瘤作用.     

pEgr1-Trail重组质粒联合电离辐射对MCF-7细胞杀伤效应的实验研究

目的研究p Egr1-Trail重组质粒联合电离辐射对MCF-7细胞的杀伤效应,为增强肿瘤放疗效果提供实验证据.方法应用Annexin V-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡;应用酶标仪检测细胞增殖;应用流式细胞仪检测细胞周期.结果不同处理组作用MCF-7细胞后24 h、不同剂量X射线照射后24 h后,各处理组MCF-7细胞的生长抑制率呈上升态势,生长抑制由弱到强的顺序为:2.0 Gy,p Egr1-Trail+0.5 Gy,5.0 Gy,p Egr1-Trail+1.0 Gy,p Egr1-Trail+2.0 Gy,Egr1-Trail+5.0 Gy.各处理组联合2.0 Gy X射线照射后6 h,细胞凋亡率开始上升,48 h达高峰,其中p Egr1-Trail+2.0 Gy组与其他各处理组比较差异具有统计学意义,且细胞凋亡最为显著(P0.05).在细胞周期方面,2.0 Gy X射线照后6 h各处理组S期细胞百分数呈现上升趋势,24 h达高峰;照后24 h,G_2+M期细胞百分数开始上升,且各处理组比较差异均具有统计学意义(P0.05);照后48 h,G_2+M期细胞百分数达到最高,依旧是p Egr1-Trail+2.0 Gy组上升最显著.结论 p Egr1-Trail重组质粒联合电离辐射作用于肿瘤细胞表现出协同杀伤效应,促凋亡作用强于单独X射照射组或p Egr1-Trail基因干预组.     

构建重组质粒pEGFP-N1-ND CyclinB1及在胃癌细胞SGC-7901中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-N1-ND CyclinB1,并观察其在人胃癌细胞SGC-7901中的表达及对SGC-7901活性的影响.方法:通过RT-PCR法扩增不可降解CyclinB1(ND CyclinB1),将其插入到pEGFP-N1载体的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-N1-ND CyclinB1,并以PCR、双酶切、测序鉴定.通过脂质体法转染胃癌细胞SGC-7901,进行荧光检测、Western blotting分析和流式细胞仪分析.结果:PCR、酶切及测序证明重组质粒pEGFP-N1-ND CyclinB1构建成功.转染胃癌细胞SGC-7901 24 h后,荧光显微镜下观察到绿色荧光.Western blotting检测到CyclinB1的表达明显增加.流式细胞仪检测重组质粒细胞组凋亡指数高于对照组,差异有显著性.结论:成功构建pEGFP-N1-ND CyclinB1荧光真核表达载体,并可在SGC-7901细胞中有效表达.     

B7-1和新型隐球菌DHA1基因嵌合重组质粒的构建

目的构建包含新型隐球菌细胞免疫主要相关基因-迟发超敏反应抗原基因(delayed-type hypersentivity antigen 1，DHA1)与小鼠共刺激分子B7-1的嵌合重组质粒。方法设计合成两对寡核苷酸引物。用PCR法分别从pUCmB7-1TM和新型隐球菌重组质粒pcDNA3-DHA1中特异扩增出编码B7-1和DHA1的基因片段(921和984bp)。分别用HindⅢ、EeoRⅠ、XbaⅠ酶切后。逐个定向连接到质粒pcDNA3中，转化宿主菌DH-5α．分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符，测序结果与献报道序列及预计结果一致。证实符合表达框架。结论本实验成功构建了新型隐球菌嵌合重组质粒pcDNA3-B7-1-DHA1。为进一步研究新型隐球菌DNA免疫奠定了基础。     

重组质粒pPRS—1超声转化蓝藻Chroococcus sp.的研究

介绍了超声转化蓝藻的方法，并用此方法获得了重组质粒ｐＰＲＳ－１转化Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．的转化藻落。从这些转化藻落中检测到重组质ｐＰＲＳ－１。此结果证明重组质粒ｐＰＲＳ－１是一种Ｅ．ｃｏｌｉ和Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．之间均可转化的穿梭质粒。     

流感病毒RNA聚合酶重组质粒pQE32-PB2-1转化效率的实验研究

目的:甲型流感病毒RNA聚合酶PB2-1亚基的基因工程重组质粒pQE32-PB2-1转化入受体菌,并优化转化条件,以建立其高效、快速的转化体系.方法:以大肠杆菌DH5α菌株为受体菌,研究了氯化钙溶液浓度(25、50、75、100mmol/L),热休克温度(30、37、42、50℃),转化时间(15、30、60、75min)及热休克作用时间(60、80、100、120sec)对基因工程重组质粒pQE32-PB2-1转化效率的影响.结果:氯化钙溶液浓度、转化时间、热休克温度、热休克作用时间对转化效率的影响有统计学意义(P<0.05).氯化钙溶液浓度和转化时间之间及热休克温度和热休克作用时间之间分别存在交互作用.结论:在本实验条件下,以75mmol/L氯化钙制备感受态细胞,转化60min,经42℃热休克作用120秒后直接涂平板选择转化子,可获得高效、快速的转化效果.     

抗肺癌单链抗体融合胸腺素α1重组体的构建

以重组质粒pET39-Tα1为模板,PCR获得Tα1基因,连接到pUCm—T载体上。对质粒pET22-SeFv、pUCm—T—Tα1双酶切,回收相应片段,将Tα1连接到SeFv的C端,成功构建pET22-SeFv—Tα1重组体。     

重组质粒pEgr-1-TRAIL辐射诱导乳腺癌细胞效应的实验研究

目的将具有辐射诱导表达特性的重组质粒p Egr-1-TRAIL转入乳腺癌MCF-7细胞中,诱导肿瘤杀伤基因TRAIL的表达,实现辐射和基因对MCF-7细胞的双重杀伤效应.方法用ELISA法检测不同剂量X射线诱导TRAIL表达的量效关系及2 Gy X射线照射后不同时间TRAIL的表达;用流式细胞仪检测不同处理组MCF-7细胞早期凋亡情况.结果不同剂量X射线照射转染p Egr-1-TRAIL重组质粒的乳腺癌细胞MCF-7,TRAIL表达量明显高于假照组(P0.001~0.05),其中5 Gy X射线照后表达量最高,TRAIL表达量为假照组的5.1倍.2 Gy X射线照射后4 h,TRAIL表达量明显升高(P0.05),并随时间延长逐渐增加,照射后32 h达峰值,表达量为照射前的4.6倍.MCF-7-p Egr-1-TRAIL/0 Gy组早期凋亡细胞百分数较MCF-7/0 Gy和MCF-7-p3.1Egr/0 Gy组明显增加(P0.01),随着照射剂量的增加,MCF-7-p Egr-1-TRAIL/5 Gy组细胞早期凋亡率与其他处理组比较均存在统计学意义(P0.001~0.05),MCF-7/0 Gy组细胞生长最快,而MCF-7-p Egr-1-TRAIL/8 Gy组细胞生长最慢.结论乳腺癌细胞转染p Egr-1-TRAIL重组表达质粒联合X射线照射能够增加MCF-7细胞凋亡,抑制其生长.     

蓝细菌新质粒载体pPRS－1的构建

以蓝细菌Ｐｌｅｃｔｃｎｅｍａｂｏｒｙａｎｕｍ内源小质粒ｐＰｂｓ（１．５ｋｂ）和Ｅ。ｃｏｌｉ质粒载体ｐＢＲ３２２（４．３ｋｂ）为材料，用限制性内切核酸酶ＣｌａⅠ分别消化，经Ｔ＿４ＤＮＡ连接酶连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞，在含Ａｍｐ（Ａｐ）和含Ｔｅｔ（Ｔｃ）的ＬＢ琼脂培养基上筛选出Ａｍｐ￣ｒＴｅｔ￣ｓ的转化子，提取转化子的质粒，用ＣｌａⅠ消化，得１．５ｋｂ和４．３ｋｂ两片段，表明转化子所含质粒是ｐＰｂｓ和ｐＢＲ３２２的重组质粒，定名为ｐＰＲＳ－１。     

聚乳酸-聚乙烯亚胺共聚物的制备、表征及其在多西紫杉醇传输中的应用研究

为了获得一种毒性低、可降解的药物载体,以Sn(Oct)2为催化剂,以1,4-丁二醇和丙交酯为原料,使用开环聚合的方法合成了聚乳酸(PLA),用异氟尔酮二异氰酸酯(IPDI)偶联小分子量的聚乙烯亚胺(2000Da),合成了阳离子嵌段共聚物聚乳酸-聚乙烯亚胺共聚物(PLA-PEI,PEA)。采用乳化溶剂挥发法,以脂溶性的PEA为基本材料,制备了疏水性核装载疏水性药物多西紫杉醇(DTX),壳为亲水性聚乙烯亚胺的阳离子纳米粒,并对PEA/DTX纳米粒的性能进行了表征和考察,包括粒度分布、形貌、电位、载药量、包封率、体外释放和细胞摄取。     

Cyclin B1、CDK1在肺癌中过表达及其意义

摘要：采用免疫组化ABC法检测12例肺癌组织、11例癌旁组织及3例正常肺组织中cyclin B1、CDK1蛋白的表达情况，以探讨细胞周期蛋白eyelin B1及细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1在不同肺癌组织中的异常表达及其临床意义。结果显示cyclin B1在正常肺组织、癌旁组织、癌组织中阳性率分别为0％、9．1％和50．0％，CDK1的阳性率则为0％、18.2％和75.0％，cyclin B1、CDK1在小细胞肺癌和鳞癌中存在广泛的过表达，而在大细胞肺癌中没有表达，并且在不同肿瘤亚型中表达也有差异性．     

Mcl-1反义寡核苷酸对肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨髓样细胞白血病-1(Mcl-1)反义寡核苷酸(ASODN)对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法:将Mcl-1 ASODN转染入体外培养的肝癌HepG2细胞。用WST-8法检测不同浓度的Mcl-1 ASODN对HepG2细胞增殖抑制率;用流式细胞仪检测Mcl-1 ASODN对HepG2细胞周期和凋亡的影响,用Hoechst33258染色在荧光显微镜下观察HepG2细胞凋亡的形态学改变。结果:Mcl-1 ASODN作用HepG2细胞48 h后,与空白对照组(blankcontrol)和随机寡核苷酸(RODN)对照组相比,Mcl-1 ASODN组能明显抑制肝癌HepG2细胞的增殖和诱导其凋亡(P<0.05),Mcl-1 ASODN组细胞出现S期明显的阻滞;Hoechst33258染色可见大量的细胞核固缩,核碎裂。结论:Mcl-1 ASODN能抑制肝癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡。     

酵母双杂交筛选血液中与PERIOD1相互作用的新蛋白

采用酵母双杂交方法,以人PER1的PAS结构域为诱饵,在人血液cDNA文库中筛选能与之相互作用的蛋白.经酶切和核苷酸序列测定,证实重组诱饵载体hper1PAS/pGBKT7构建成功.血cDNA文库转化效率为1.4×106/3μg pGADT7-Rec.酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆.     

重组人硫氧还蛋白对大鼠内毒素肺损伤保护作用

目的:探讨重组人硫氧还蛋白1(rh Trx-1)对新生SD大鼠急性内毒素肺损伤的保护作用.方法:制备、鉴定rh Trx-1;将新生SD大鼠分为对照组、脂多糖(LPS)实验组和LPS+rh Trx-1干预组.腹腔注射LPS(质量分数为5 mg/kg),制备急性内毒素肺损伤模型,干预组于LPS注射前30 min腹腔注射rh Trx-1(质量分数为10 mg/kg),观察注射后24 h各组新生SD大鼠的一般情况以及死亡率;重复实验,每组分别于实验后的2、8 h随机处死大鼠,提取肺组织用于病理切片观察.结果:(1)成功制备rh Trx-1;(2)LPS组大鼠表现出活动少,反应差,精神萎靡,毛发无光泽,口周发绀等全身炎症反应症状,濒死状态时表现为毛色青灰,呼吸浅表;LPS+h Trx-1干预组动物症状明显减轻;阴性对照组、LPS实验组和LPS+rh Trx-1干预组大鼠24 h死亡率分别为0%,67%、17%(2=14.400,P=0.001);(3)LPS组肺组织损伤严重,可见肺组织结构不完整,肺泡间隔明显增宽,肺泡腔内有红细胞、炎症细胞及浆液渗出,血管周围组织可见白细胞浸润,毛细血管有明显充血及扩张表现,随时间延长有加重趋势,LPS+rh Trx-1干预组病理改变较内毒素组明显减轻,肺泡结构尚正常,轻度肺水肿,肺泡间隔稍增宽,红细胞渗出明显减少,肺泡及肺间质中白细胞浸润减少.结论:重组人硫氧还蛋白1对急性内毒素肺损伤的新生大鼠具有保护作用.     

人扁桃体淋巴细胞cDNA质粒重组体的构建

目的：通过构建人扁桃体淋巴细胞cDNA质粒重组体，为深入研究淋巴细胞的生物学功能奠定实验基础。方法：采用DNA重组技术，以人新鲜扁桃体淋巴细胞为实验材料从中提取mRNA，以mRNA为模板合成cDNA，然后与质粒pSPORTI进行定向连接并转入到E．coliJM109中进行分子克隆。结果：阳性克隆占90％，阴性克隆占10％；转化率为1．35×104克隆／微开连接体系；插入片段长度为0．5～2．3Kb，平均1．3Kb。结论：人扁桃体淋巴细胞cDNA质粒重组体构建成功。     

Effects of enhancing p21 waf1 on proliferation and expression of G1cyclins andCDKs in human breast cancer cells

The cyclin-dependent kinase inhibitor p21( waf1/cip1/sdil) is an important negative regulator in control of cell cycle. Its functions of inhibiting cancer cell growth and its effects on expression of G1 phase cyclins and related CDKs are a worthy topic for study. The plasmid expressing p2l with high level was transformed to human breast cancer cells, and the expression of p2l in cells was enhanced, then the cell growth rate, anchorage-independent growth and tu-morigenecity were tested, at the same time the expression levels of cyclinD1, CDK4, cyclinE and CDK2 were analyzed by Northern blot. The results showed that since the expression of p21 was enhanced in the cell, the rate of cell growth and anchorage-independent growth was inhibited, tumorigenecity was suppressed, the level of expression of cyclinE and CDK2 decreased while that of cyclinDl and CDK4 was not affected. It is suggested that the enhanced expression of p21 markedly inhibits the proliferation and lessens the tumorigenecity of breast cancer cells, and that p2l expression is not related to that of cyclinDl and CDK4, but affects the expression of cyclinE and CDK2 .     

2-ME抑制人子宫内膜癌细胞株增殖的研究

目的　探讨2-甲氧雌二醇(2-ME)对人子宫内膜癌细胞株KLE细胞体外增殖和凋亡的抑制作用.方法选用人子宫内膜癌细胞株KLE进行体外培养,实验组加入不同浓度2-ME的培养液,对照组不含2-ME.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察2-ME对人子宫内膜癌细胞株KLE增殖的抑制作用;药物作用后的克隆形成实验;电子显微镜(电镜)观察细胞形态变化;流式细胞仪(FCM)观察细胞的凋亡率及细胞周期的变化.结果2-ME浓度为10.0～50.0μM时,明显抑制KLE细胞的增殖(P<0.01),并具有时间依赖性和剂量依赖性.2-ME作用后G0/G1期细胞增加,并伴随G0/G1期细胞的增加,出现细胞凋亡峰和凋亡率的升高(P<0.05).电镜下观察到KLE细胞染色体边集、核固缩、凋亡小体.结论2-ME对人子宫内膜癌KLE细胞株增殖有抑制作用,并能促进其凋亡.     

重组胸腺素α1在大肠杆菌中的融合表达及培养条件的优化

采用三角摇瓶来摸索BL21(DE3)/pET28A-Tα1菌种表达目的蛋白的最优发酵条件,并在此基础上在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中,利用补料分批培养技术,流加甘油,进行发酵培养;利用Western blotting进行发酵产物鉴定. 摇瓶培养最优条件:10%接种量、25 mL LB培养基、37 ℃培养, 0.02 g/mL的甘油做碳源,接种后4 h加入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,诱导3h后目的蛋白表达量最高. BL21(DE3)/pET28A-Tα1菌种在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中的条件为:以10%的接种量接种到3L发酵培养基中,设定溶氧40%,pH7.0,温度37 ℃,通气量3 L/min,快速流加甘油60 g ,培养4 h后,加入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,诱导3 h后终止发酵. 发酵罐中获得的菌体量为36 g/L,蛋白表达率为10%左右.     

龙血竭对Lewis肺癌小鼠放疗模型的辅助治疗效果

 龙血竭具有一定的防辐射作用。通过在C57/BL 小鼠右前腋窝皮下注射Lewis 肺癌细胞, 对小鼠进行4 Gy 全身一次性γ辐射建立Lewis 肺癌小鼠放疗模型, 并给予小鼠龙血竭, 进行肿瘤生长、肿瘤转移和血象变化检测, 研究了龙血竭对Lewis 肺癌小鼠放疗模型的血象及肿瘤生长的辅助治疗效果。实验发现, 龙血竭不会促进放疗Lewis 肺癌小鼠的肿瘤生长和转移, 并能够有效保护放疗Lewis 肺癌小鼠的血小板。研究表明, 龙血竭应用于肿瘤的放射治疗可以对辐射引起机体的血象损伤起到保护作用。