人卵冷冻保存技术的进展(综述)

冷冻保存（Cryop～rvahon）是当前人类生殖工程中可以实施的技术之一。应用冷冻保存技术，人的早期胚胎解冻后又可以获得较好的存活率和妊娠率。但是，冻存的胚胎有时会因为其“父母”已成功怀孕而变为多余，如何处置这些已有“生命”的胚胎等问题常常引致一些道理伦理及法律的争议。如果直接冷冻保存卵子则可以避免这些问题。而且，卵子的冷冻保存还能够使那些在生育年龄前卵巢功能遭受损伤的病人有生育的机会。许多学者曾对卵子的冷冻保存进行过探索，所采用的冻存技术多从成功的胚胎冻存技术改良而来。然而，与胚胎冷冻保存的成功率相比…     

Smad2基因敲除小鼠冷冻胚胎库的建立

目的 建立Smad2基因敲除小鼠胚胎库。方法 利用OPS法对Smad2基因敲除小鼠胚胎进行玻璃化冷冻保存,并比较不同杂交组合小鼠的超数排卵数、解冻胚胎的复苏率及发育率。结果 两组不同杂交组合（Smad2^＋/－♂×Smad2^＋/－♀和Smad2^＋／－×Smad2^＋／－♀）小鼠平均超排卵数分别为14．13枚和24．60枚;复苏率分别为90．16％和91．67％;囊胚发育率分别为73．08％和77．05％。这些结果表明Smad2基因敲除杂合子母鼠的超排数量明显低于野生型母鼠的超排数量,而二者胚胎解冻后的复苏率和囊胚发育率没有显著差异。因此我们主要通过对野生型小鼠超数排卵,然后与Smad2基因敲除杂合子雄鼠交配的方法获取胚胎,进行玻璃化冷冻保存,现已冻存胚胎1256枚。结论 成功建立了Smad2基因敲除小鼠胚胎库。     

DAP 玻璃化冷冻液对小鼠2-细胞胚胎的冷冻保存

摘要: 目的探索和优化小鼠2-细胞胚胎冷冻效果,建立小鼠胚胎冷冻保存技术以及超低温保存模型动物胚胎实验室所需的相关技术。方法选择3 个品系( C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － ) SPF 级4 周龄雌性小鼠,运用超数排卵、体外受精、玻璃化冷冻法,以及二细胞期胚胎复苏、体外培养等技术方法,观察上述实验效果。结果C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － 3 个品系小鼠超数排卵平均值分别为42. 98 个/只、27. 93 个/只、23. 11 个/只,体外受精2-细胞期胚胎率分别为68. 79%、32. 70%、23. 08 %,胚胎冷冻复苏后胚胎回收率72. 77%、80. 87%、83. 33%,存活率分别为56. 92%、54. 84%、70%,存活胚胎体外培养发育到囊胚比率分别为72. 37%、60. 78%、25%。结论选择4 周龄小鼠,按预定相同的技术方法做超数排卵、体外受精、胚胎冻存、胚胎复苏,呈现出较好效果,C57BL/6 小鼠优于基因工程小鼠,基本建立起小鼠2-细胞胚胎冷冻保存技术。     

大鼠胚胎成纤维细胞的原代培养和分裂抑制

大鼠胚胎成纤维细胞（REF）可以作为培养大鼠胚胎干细胞的滋养层．对REF进行分离、原代培养、冻存和有丝分裂抑制,得出如下结论：分离REF时使用组织块生长法优于胰酶消化法;应用血清含量〉40％、DMSO含量为20％的冻存缓冲液能在冻存时最大程度地降低REF所受的伤害;进行REF分裂抑制时使用丝裂霉素C处理的最适终浓度为3ug／m1．     

遗传工程小鼠冻存卵巢异体原位移植比较研究

目的 对 C57BL / 6 J 为背景的遗传工程小鼠卵巢冷冻及复苏后原位移植进行研究,建立遗传工程小鼠卵巢 冷冻方法,弥补小鼠资源保种体系。 方法 采用 DAP213 方法冷冻保存了 C57BL / 6 J 及 SCARB2、PSGL1、IGB3S 三 个遗传工程小鼠 10 日龄幼鼠的卵巢,将四个品系 10 日龄幼鼠的新鲜卵巢及冻存复苏卵巢原位移植到 4 周龄 C57BL / 6 J 及 C57BL / 6 J( Cg) —Tyrc- 2 J / J( B6 albino)受体雌鼠,术后饲养 5 周与 10 周龄性成熟 C57BL / 6 J 雄鼠交 配,观察移植出生幼仔。 结果 C57BL / 6 J 新鲜卵巢和冻存卵巢,三个品系遗传工程小鼠的冻存卵巢原位移植到 C57BL / 6 J 和 B6 albino 受体中,均可以恢复正常功能,交配后得到仔鼠。 结论 采用 DAP213 方法冻存 C57BL / 6 J 及以 C57BL / 6 J 为背景的遗传工程小鼠卵巢,复苏后原位移植到 C57BL / 6 J 和 B6 albino,交配后产仔,卵巢冻存方 式是小鼠资源库保存的一个重要补充。     

二乙酰荧光素评估小鼠玻璃化冷冻胚胎活力试验

在形态学鉴定基础上，用二乙酰荧光素（ＦＤＡ）评估小鼠玻璃化冷冻胚胎的活力，并摒弃受损伤严重的胚胎，将活力较强的胚胎移植给受体，采用此法能得到较好的冻胚移植体内发育率，与鲜胚移植相比较无显著差异，冻胚解冻后只需２分钟便可鉴定出胚胎活力。     

嗜凤梨果蝇(Drosophila ananassae)细胞系的建立及其生物学特性初步观察

为建立真核基因表达受体系统,以嗜凤梨果蝇胚胎为材料,采用常规方法获取发育4～8h的果蝇胚胎细胞,以改良M3(BF)培养液体外培养,经40d左右的原代培养后行传代培养,以后每隔7d传代一次,传至10代时按照细胞系建立标准检测细胞系的一系列生物学特性.结果显示:细胞维持体外生长将近1年,传至60代.细胞在接种的0～96h内呈指数生长,临界增殖浓度为1.0×106个(细胞) mL.部分细胞染色体呈现异倍化.经液氮冻存的细胞复苏后活性达90%以上.该细胞系是一株成功的细胞系,命名为HY-ANA.     

人外周血DC细胞的冻存

目的:探讨人外周血DC细胞的冻存方法和意义。方法:通过树突状细胞的分离和培养,抗原标本前处理,抗原的装载,实验分组,细胞冻存等,研究树突状细胞冻存情况。结果:冷冻DC细胞保持了它的特性,但会因冻溶过程中生物特性有所减低。结论:我们在应用冻存DC细胞时应考虑增加输入细胞的量。     

小鼠胚胎干细胞R1表面特异结合多肽的筛选

胚胎干细胞是从哺乳动物胚胎发育早期的囊胚的内细胞团内分离出来的一类细胞,具有自我更新和全能性的基本特征.作者利用M13噬菌体展示技术筛选与未分化的小鼠胚胎干细胞R1表面特异结合的多肽.实验利用未分化的小鼠胚胎干细胞为筛选靶细胞,分化的小鼠胚胎干细胞为吸附细胞,进行3轮的消减筛选,经细胞ELISA鉴定,噬菌体DNA测序和多肽序列分析,得到13条能与小鼠胚胎干细胞特异结合的多肽.通过BLASTP比对发现有11个体内的同源蛋白,为进一步研究小鼠胚胎干细胞表面分子提供研究基础.     

小鼠胚胎快速冷冻方法的研究

3770枚小鼠胚胎随机分为以下12个试验组:三个不同浓度甘油(2.1、2.8和3.5M)分别与四个浓度蔗糖(0.25、O.5、0.75和1.00)配合成12种不同高渗快速冷冻液。通过对比筛选试验,对昆明小鼠的紧缩致密期早囊胚快速冻存试验.确定3.5M甘油和0.25M蔗糖混合成的快速冷冻液为最佳组合,用其处理的胚胎,经快速冷冻、解冻后。胚胎体外培养发育率最高,达84.3％,其中膨胀期和孵化期胚胎为78.3％,明显高于其它11种组合(P<0.01)。     

梯度蔗糖诱导黄皮胚轴脱水耐性后超低温保存

梯度蔗糖预培养能增强黄皮胚轴的脱水耐性,使胚轴含水量下降至17.6%仍保持活力,在含NAA和IAA的WPM培养基上可诱导植株再生.黄皮胚轴脱水至18%后分别采用直接冻存法、抗冻剂冻存法、微滴冻法和玻璃化法超低温保存都不能复活.玻璃化冻存后的胚芽超微结构基本完整,若能继续优化冻存和培养条件,有希望获得存活的胚芽及其再生植株.     

超低温慢速冻存与玻璃化冻存对大鼠骨髓细胞存活率的影响

本文对大鼠骨髓细胞的常规慢速冻存和玻璃化法冻存进行了比较研究，实验结果表明：玻璃化法冻存较短时间的骨髓细胞的回收率和存活率与慢速冻存相比无显著差异，具有一定的可行性。     

生殖细胞及胚胎冻存技术发展及展望

生殖细胞及胚胎冷冻保存是生物种质资源保护及开发的重要技术,为人类自身健康医学发展、遗传育种、养殖生产和生物资源保护等提供重要支持。研究认为,针对不同物种及不同类型生殖细胞及胚胎的特点,冷冻保存技术具有较大差异。目前,生殖细胞及胚胎冷冻保存技术主要分为慢速冷冻和快速冷冻,对冷冻对象均具有较大程度损伤。而不同冷冻保护剂的运用可有效降低不同冷冻技术应用时对生殖细胞及胚胎的损伤作用。查找和优化冷冻方法类型及冷冻剂配方,是针对研究对象建立适合的冷冻技术的关键。本文以现有研究为依据,对动物精子、卵母细胞和胚胎的冻存方法进行梳理并展开综述,以期为相关研究及技术人员提供参考。     

胚胎单个定位及三维共培养微流控装置的构建

胚胎体外发育是临床人工辅助生殖技术中的关键环节,对着床后胚胎发育状况有重要作用。该研究利用细胞三维培养技术和微流控芯片技术构建了一种新型的小鼠胚胎体外共培养装置,用于实现自动化的小鼠胚胎定位与共培养操作,并对胚胎在体内的发育环境进行模拟。利用该微流控装置成功进行了小鼠胚胎的单个定位、三维细胞共培养以及发育追踪观察,并对装置中胚胎发育状况做出评价。统计结果表明:共培养芯片中小鼠胚胎发育囊胚率(87.3%±3.1%)显著高于对照组的囊胚率(76.8%±2.7%,P0.01);并且共培养芯片中小鼠囊胚的平均细胞总数(102±4)也显著高于对照组中的平均细胞总数(68±3,P0.01)。因此该胚胎共培养微流控芯片有助于在体外实现自动化的胚胎定位和培养过程,并且对小鼠胚胎发育具有更好的促进作用。     

脂肪间充质干细胞冻存及成骨诱导的实验研究

研究了脂肪间充质干细胞(ADMSCs)冻存的条件,观察低温冻存对ADMSCs的一般生物学特征及成骨分化潜能的影响。酶消化法分离培养人ADMSCs,液氮中冻存6月,复苏后倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况,台盼蓝染色检测存活率,MTT法绘制生长曲线,地塞米松、左旋抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、1,25-(OH)2VitD3成骨诱导,免疫细胞化学染色行成骨鉴定。人体脂肪组织中存在ADMSCs,经冻存复苏后,细胞存活率较高,细胞形态及生长曲线与冻存前无明显差别,经成骨诱导后仍可表达骨钙素(OC)和I型胶原。证实人ADMSCs可以耐受体外低温冻存,且能够保持稳定的一般生物学性状及成骨分化潜能。     

鳜鱼基因组DNA的提取及PCR-SSCP条件的探讨

采用改良苯酚氯仿法,分别提取鳜鱼冻存血液、新鲜血液、冻存肌肉、新鲜肌肉的DNA并进行了效果比较,发现新鲜及冻存样品提取效果差异不大.以基因组DNA为模板,对鳜鱼生长激素基因第五至第六外显子进行PCR-SSCP分析,在SSCP分析过程中,对温度、电压条件进行了优化,在五组条件中,4℃、160V条件下效果最好.     

小鼠着床前胚胎Dicer 1和DGCR 8基因的表达

研究了miRNA生成相关基因Dicer 1和 DGCR 8在小鼠着床前胚胎各发育阶段的表达,探讨其对着床前胚胎发育的作用.建立小鼠超排、交配系统,采集着床前胚胎;采用二步法RT-PcR方法鉴定着床前胚胎Dicer1和DGcR 8表达.结果显示:小鼠卵母细胞及受精后1.5 d、2.5 d、3.5 d和4.5 d着床前胚胎均表达Dicef 1和DGcR 8基因.这是着床前胚胎IlliRNA生成物的重要基因,miRNA及其生物合成相关基因可能对着床前胚胎发育起重要作用.     

冷冻保存小鼠胚胎简易方法的研究

小鼠胚胎在冷冻保护剂二甲亚砜(DMSO)存在下,冷冻到-196℃,解冻以后可以存活。在无胚胎冷冻机的条件下,我们用简易冷冻装置,将不同胚龄的鼠胚放入其中,经缓慢降温后保存于液氮内。冷冻胚胎快速解冻后,胚胎回收率达67—79%。选择解冻后正常胚胎进行体外培养,48—72小时后能进一步发育为其存活标准,冷冻后胚胎存活率为66.07%。此方法简便易行便于推广。     

人毛乳头细胞的冻存

寻找一种不影响人毛乳头细胞生物活性的冻存方法，采用标本沉降式液氮冻存方法，冻存新分离的人毛乳头；在冻存1月、3月和6月时解冻复苏，接种培养，观察毛乳头的贴壁率和细胞生长情况，复苏冻存了1月、3月和6月的毛乳头，培养2天时毛乳头贴壁率为90％－95％左右，与新分离的毛乳头贴壁率相近；瓶内细胞融合时间也基本相同，为15天。液氮冻存人毛乳头不会影响其细胞生物活性，值得推广。     

兔组织工程化骨膜冻存前后异体移植早期外周血T淋巴细胞亚群的检测

本实验应用MSCs及成骨诱导培养的MSCs作为种子细胞与SIS复合构建组织工程化骨膜并冻存,与未冻存的组织工程化骨膜同时植入同种异体新西兰兔皮下,通过对外周血T淋巴细胞亚群的检测,初步探讨其免疫原性。本研究结果表明,以同种异体MSCs及经成骨诱导后的MSCs构建组织工程化骨骨膜冻存前后植入异体兔体内其免疫反应水平低。