聚合酶链式反应递缩基因组文库以克隆抗生素生物合成基因簇

在克隆阿维菌素(avermectin)生物合成基因簇的过程中,探索出了一条运用聚合酶链式反应(PCR)扩增技术对链霉菌基因组文库进行递缩法筛选、以克隆抗生素生物合成基因簇的新方法.依次以96孔培养板整板混合质粒、单排混合质粒和单个菌落为模板进行PCR扩增,以逐步递缩的方式定位包含目的基因的克隆.结果表明,与传统的菌落原位杂交方法相比,该方法具有简单、快捷、准确率高等优点.     

牦牛PKN2基因克隆与组织表达特性的分析

克隆牦牛蛋白激酶N2(Protein Kinase N2,PKN2)基因编码序列(Coding sequence, CDS),预测和分析PKN2基因的生物学特性,并探究在不同的组织中的表达规律.以牦牛的脂肪cDNA为模板,用PCR技术克隆PKN2基因;使用MEGA7.0、SOPMA和TMHMM等进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR技术PCR分析牦牛PKN2基因在心脏、肝脏、脾脏等组织的mRNA水平的表达.结果显示,PKN2基因CDS区长942 bp,编码313个氨基酸,分子量为107 315.25 u,分子式C₄₇₄₂H₇₅₃₅N₁₃₁₉O₁₄₄₂S₃₈;PKN2蛋白为不稳定的亲水蛋白,具有101个磷酸化位点;跨膜结构预测显示不存在跨膜结构区和信号肽;PKN2的二级结构主要以α-螺旋(41.61%)为主;与其他物种的同源性分析结果显示,牦牛PKN2基因与普通牛的同源性最高(99.84%),与鸡的同源性最低(84.59%),符合物种进化规律.qPCR技术显示PKN2基因在牦牛脂...     

风疹病毒E1抗原基因片段的拼接及原核表达

应用基因克隆技术,对风疹病毒E1抗原基因片段进行拼接及克隆表达．根据软件GOLDKEY预测E1抗原的主要抗原决定簇位点E1(243～286aa),再设计4条近60个碱基长引物,利用PCR仪延伸合成目的基因,酶切并构建重组表达载体,酶切与测序鉴定,再转化表达菌株BL21(pLYS),IPTG诱导表达,行SDS-PAGE检测到目的基因表达成功．结果实现了用基因克隆技术将含E1(243～286)片段的pETKDO载体向大肠杆菌的转化,IPTG诱导2h,获得的表达量高。     

PCR法快速鉴定阳性克隆实验的改进

分析了常规PCR扩增鉴定阳性克隆实验中存在的问题,进行了改进探索:反转录PCR(RT-PCR)获得目的基因片段,TA克隆连接质粒载体、转化大肠杆菌感受态细胞;利用目的基因的特异性引物,用菌液PCR法直接筛选重组克隆,在筛选的阳性菌液中扩增到与目的基因片段大小一致的阳性条带,与质粒PCR及酶切的阳性对照一致,验证了菌液PCR具有可靠性。实验证明,自身引物菌液PCR法用于定性筛选重组阳性克隆,是一种简便、快速、有效的方法。     

酿酒酵母2B-39 sam 2在大肠杆菌中的克隆及表达

构建S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(sam2)的基因工程菌,为S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的工业化生产提供参考。应用PCR技术从酿酒酵母的总DNA中扩增出1.2kb的sam2,构建重组载体pET28a-sam2,将其转入大肠杆菌进行表达和分析。SDS-PAGE显示重组克隆表达的SAM2分子量约47kD,重组蛋白量约细菌总蛋白的20.1%,酶活达到19.6nmol/(h.mL),大肠杆菌表达出了具有生物活性的sam2。     

Reteplase基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

进行了组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体Reteplase(r-PA)基因的克隆,并在甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)中实现了胞外表达。以基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)306染色体DNA为模板,通过PCR技术克隆了r-PA基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上并进行了序列测定。测序结果表明:克隆到的基因序列长1.1 kb,与已发表的Reteplase基因同源性达99.91%,其编码的氨基酸顺序一致。文中还构建了甲醇毕赤酵母分泌性表达载体pMETαA-r-PA,用PacⅠ单酶切将pMETαA-r-PA线性化后,采用电转化的方法将其导入甲醇毕赤酵母PMAD16中,PCR和表型鉴定表明,筛选到Reteplase基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上的阳性克隆。经摇瓶初步培养及以甲醇为唯一碳源诱导表达,胞外Reteplase表达水平最高达27.93mol/(s.L)。     

曼氏无针乌贼微卫星DNA富集文库构建与鉴定

曼氏无针乌贼是我国四大海产之一,开发其微卫星标记具有重要的科研与应用价值。本研究采用FIASCO法(Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats)构建了曼氏无针乌贼的(CA)n微卫星富集文库,通过PCR检测出640个阳性克隆,占所有克隆的87%,从阳性克隆中随机选取118个进行测序,序列分析发现,103个克隆含有7次以上的重复序列,其中完全的为67(65%)个,不完全的23个(22.3%),复合的为13(12.7%)个,重复次数范围为7~59次,平均为38次。在103个序列中共42条可以设计引物,所筛选出的引物可以用于评估曼氏无针乌贼种质资源遗传多样性、遗传结构、亲子鉴定以及放流效果评估等。     

Mi基因过表达载体和16D10基因RNAi载体的构建及转化

文中采用PCR技术从番茄中克隆获得了Mi基因,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从来源于红橘（Citus reticulate）的根结线虫中克隆获得了16D10基因,采用DNA重组技术构建了Mi基因的过表达载体和16D10基因的RNAi载体,分别命名为pB-Mi和pB-16DR. 通过根瘤农杆菌介导的遗传转化,获得了经PCR检测为阳性的沙田柚转基因植株. 这一结果将为研究Mi基因过表达和16D10基因的RNA干扰对柑橘根结线虫病的抗性影响提供试材和技术支持.     

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。     

PCR技术在基因突变检测中的应用

ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技术以其具有高特异性、高效率、高灵敏度而广泛地应用于基因突变研究中，近年来，ＰＣＲ技术不仅推动了以往基因突变检测技术的发展，而且建立于ＰＣＲ技术之上的新技术设计先进、操作方便省时，具有更广阔的实用性。文中对这些基因突变检测技术的原理、特点及应用给以综述。     

果实特异表达芪合酶基因的表达载体构建及农杆菌重组

本研究利用基因工程技术构建了附加果实特异表达启动子的芪合酶基因植物表达载体，并通过农杆菌直接转化技术将其转入LBA4404、EHA105，并采用PCR及限制性酶切分析对所获得的农杆菌工程菌株进行鉴定。为利用芪合酶基因转化植物并在食用果实中产生白藜芦醇做准备。     

mRNA差异显示技术及其在植物基因工程中的应用

mRNA差别显示技术是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术,目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因.本文介绍了mRNA差别显示的基本原理、技术路线以及反应条件的改进方法,最后指出了此技术在植物基因工程中的应用.     

二甲亚砜在聚合酶链反应扩增载脂蛋白E基因中的作用

目的：探讨二甲亚砜（DMSO）在聚合酶链反应（PCR）中扩增人类载脂蛋白E基因中的作用。方法：在不同质量分数DMSO的存在下,以PCR技术增人类载脂蛋白E基因片段。限制性内切酶酶切检测扩增产物。结果：在质量在分数5%-10%的DMSO下,可以成功地扩增到人类载脂蛋白E基因的第4外显子片段。结论：在DMSO作用下,PCR扩增增强了特异性。扩增的人类载脂蛋白E基因片段可以进行基因限制性片段多态性的分析。     

一种新型PCR扩增仪的温控系统

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）又称为PCR．PCR自20世纪80年代初发明以来,已迅速发展成为生物科学研究和基因诊断领域的最重要的新技术．PCR技术依赖设定的温度循环,以控制酶促进反应的自动进行。从而达到基因扩增的目的．目前实验室广泛使用的PCR基因扩增仪,主要采用国际上通用的时间控制半导体温控系统,成本较高且不易实现．利用毛细管流体在不同管道部分的流体分部,通过控制不同管道部分的温度,可以巧妙地实现流体在不同温度条件下的循环,且与毛细管电泳技术相结合,还可以实现在线检测,从而以更简化的方式,实现PCR的自动化控制与分析．该文介绍这种适合PCR扩增仪的恒温系统,包括系统的立体螺旋结构设计、单片机温控系统的设计等．     

半套式PCR技术在植物基因克隆中的应用

常规ＰＣＲ方法在分离克隆已知序列的基因中发挥着重要的作用，但要求目的基因片段与引物间的同源性几乎是１００％，一旦引物序列与目的基因间存在有差异，便往往会导致扩增的特异性不强，扩增效率不高，给克隆带来很大的困难．在常规ＰＣＲ基础上，若所分离的基因在不同植物间存在保守序列，依据这一序列再合成一对引物，进行半套式ＰＣＲ则能大大提高扩增的特异性及扩增效率．对于较长的基因片段而言还能同时完成亚克隆．本文依据南瓜ＧＰＡＴ（甘油－３－磷酸酰基转移酶）基因ｃＤＮＡ序列及比较拟南芥菜、豌豆间在该基因内的保守区段序列合成相应引物来分离克隆黑子南瓜及西瓜ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ片段为例来说明半套式ＰＣＲ技术在植物基因克隆中的应用     

PRV广东株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定

根据伪狂犬病病毒（PRV）Rice株gE基因的序列设计并合成了1对引物,以我国PRV地方毒株广东株的基因组DNA为模板,通过PCR方法获得了一大小约1.6kb的DNA片段,并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序,序列测定结果显示,该片段长1665bp,编码555个氨基酸,与PRV Rice株gE基因的核苷酸序列同源性为97.7%,氨基酸序列同源性为95.9%。     

平板影印与AHBA合成酶基因筛选用于安莎类抗生素产生菌的分离

基因筛选是筛选具有抗生素产生潜力微生物的新方法.针对筛选中单菌落分离纯化不仅工作量大,而且耗费时间,采用一种将平板影印技术与PCR扩增技术相结合从土壤中快速获得具有安莎类抗生素产生潜力的放线菌的方法.根据安莎类抗生素合成途径中的3-氨基-5-羟基苯甲酸合成酶(AH BAs)基因的保守性,通过放线菌的培养、影印、AH-BAs基因的PCR扩增,已从33份土样中获得8株AHBAs阳性菌株.结果表明:该方法是一种非常有效的能够快速获得AHBAs基因阳性菌株的方法,并且该方法可扩展用于从土壤中分离其他有价值的抗生素产生菌.     

错配PCR对牛X染色体相关基因杂合子的检测

利用DNA测序技术,在荷斯坦奶牛胎儿中找到X染色体基因GLRA2 3'端的杂合位点(C/T),设计错配引物在该位点对胎儿及其父本、母本基因组进行PCR扩增,建立起GLRA2基因的错配PCR技术,该技术可以快速在群体基因组中检测这一杂合位点.     

绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子载体的构建及表达

用PCR技术分别从人和绵羊基因组DNA中扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,hALR)基因和绵羊β-乳球蛋白(sheep beta-lactoglobulin,BLG)基因启动区序列,从pEGFP-C1质粒中扩增增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green fluorescence protein,EGFP)基因及其表达调控元件．由质粒p7zf( )构建成ALR基因乳腺特异表达、EGFP基因非组织特异性表达载体．同时体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(sheep fetal fibroblast cells,SFFCs),脂质体介导载体DNA转染SFFCs,激光共聚焦显微镜观察和PCR检测转基因细胞,结果表明,增强绿色荧光蛋白基因在SFFCs中表达,转基因细胞中可扩增出BLG、ALR、EGFP基因条带．