不同倍性鲤科鱼CyclinB基因内含子克隆与进化分析

运用PCR扩增、克隆、测序等技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、五倍体鲫鲂和团头鲂、草鱼、鲢鱼、鳙鱼等鲤科鱼CyclinB基因部分DNA序列．结合异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼CyclinB基因对应DNA序列,对不同倍性鲤科鱼类CyclinB基因DNA片段序列进行比较分析．结果表明：由相同引物扩增的染色体数为48的鲂、草、鲢、鳙鱼,只扩增出1条DNA片段,片段长度分别为750bp,950bp,720bp和720bp,而染色体数目加倍的红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、异源四倍体鲫鲂,扩增出2条DNA片段（1200bp和900bp）,三倍体和五倍体鲫鲂扩增出3条DNA片段（1200bp,900bp和750bp）,每个DNA片段均含CyclinB基因第2,3内含子和第2,3,4外显子．序列分析表明,四倍体鲫鲤、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂与其母本1200bp片段同源性分别为99．5％,98．9％,99．5％和88．7％,与母本900bp片段同源性分别为97．5％,94．6％,94．2％和89．99／6,说明四倍体鲫鲤与多倍体鲫鲂1200bp和900bpCyclinB基因片段与母本红鲫同源性高,在进化上具有偏母性遗传特性．而三倍体和五倍体鲫鲂的750bpCyclinB基因片段-9父本同源性分别高达98．6％和98．2％,说明其来自父本团头鲂．在两性可育的异源四倍体鲫鲤和异源四倍体鲫鲂中存在各自父本CyclinB基因片段序列消除现象．此外,用CyclinB基因内含子3序列构建不同倍性鲤科鱼的系统进化树,结果表明,由CyclinB基因内含子序列构建的系统进化树可以正确反映亲缘关系较近的鲤亚科属间鱼类系统进化关系,而不适合亲缘关系较远的亚科间杂交鱼类系统进化分析．     

不同倍性鲤科鱼Cyclin B基因内含子克隆与进化分析

运用PCR扩增、克隆、测序等技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、五倍体鲫鲂和团头鲂、草鱼、鲢鱼、鳙鱼等鲤科鱼Cyclin B基因部分DNA序列.结合异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼cyclin B基因对应DNA序列,对不同倍性鲤科鱼类cyclin B基因DNA片段序列进行比较分析.结果表明:由相同引物扩增的染色体数为48的鲂、草、鲢、鳙鱼,只扩增出1条DNA片段,片段长度分别为750 bp,950 bp,720 bp和720 bp,而染色体数目加倍的红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、异源四倍体鲫鲂,扩增出2条DNA片段(1200 bp和900 bp),三倍体和五倍体鲫鲂扩增出3条DNA片段(1200 bp,900 bp和750 bp),每个DNA片段均含Cyclin B基因第2,3内含子和第2,3,4外显子.序列分析表明,四倍体鲫鲤、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂与其母本1200 bp片段同源性分别为99.5%,98.9%,99.5%和88.7%,与母本900 bp片段同源性分别为97.5%,94.6%,94.2%和89.9%,说明四倍体鲫鲤与多倍体鲫鲂1200 bp和900 bpCyclin B基因片段与母本红鲫同源性高,在进化上具有偏母性遗传特性.而三倍体和五倍体鲫鲂的750 bp Cyclin B基因片段与父本同源性分别高达98.6%和98.2%,说明其来自父本团头鲂.在两性可育的异源四倍体鲫鲤和异源四倍体鲫鲂中存在各自父本Cyclin B基因片段序列消除现象.此外,用Cyclin B基因内含子3序列构建不同倍性鲤科鱼的系统进化树,结果表明,由Cyclin B基因内含子序列构建的系统进化树可以正确反映亲缘关系较近的鲤亚科属间鱼类系统进化关系,而不适合亲缘关系较远的亚科间杂交鱼类系统进化分析.     

不同倍性鲫鲂高迁移率族蛋白1基因的克隆和原核表达

用RACEPCR技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、红鲫和团头鲂的高迁移率族蛋白1基因（HMGj）mRNA全长序列,其开放阅读框包含579nt,翻译成193个氨基酸．不同倍性鲫鲂HMG1的cDNA和氨基酸序列比较分析表明：在cDNA水平上,四倍体鲫鲂与母本红鲫的同源性（99％）高于同父本团头鲂的同源性（97%）;三倍体鲫鲂与父母本同源性（95％）低于亲本之间的同源性（98％）;在氨基酸水平上,四倍体鲫鲂与父母本的同源性（100％）高于三倍体鲫鲂与亲本的同源性（97％）．结果表明：远源物种间的杂交对两性不育的三倍体鲫鲂HMG1基因造成了一定的冲击,分子遗传效应表现为三倍体鲫鲂HMG1基因位点发生了变异;四倍体鲫鲂HMG1氨基酸序列与亲本的完全一致性,克服了等位基因的杂交不亲和性,为两性可育的异源四倍体鲫鲂遗传稳定奠定了基础．生物信息学分析表明：HMG1蛋白二级结构具有8个螺旋和3个转角,HMG1蛋白三级结构于N-端具有两个DNA结合基序,C-端具有一长为23个重复D或E的氨基酸尾．这种结构决定了HMG1能够与核DNA发生“蛋白-DNA”的相互作用,参与多种核内生物学功能的完成．另外,以HMG1氨基酸序列构建了鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的进化树,结果提示HMG1是一种古老的蛋白质,并在物种演化中具有保守性;首次构建了鱼类HMGl原核表达载体,外源的鱼类HMG1基因编码蛋白在原核细胞中得到了表达,这为下一步HMG1蛋白的制备和生物学功能、尤其与DNA转座子相互作用的研究提供了条件,将助于了解物种间的杂交形成异源多倍体的机制．     

不同倍性鲫鲂高迁移率族蛋白1基因的克隆和原核表达

用RACE PCR技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、红鲫和团头鲂的高迁移率族蛋白1基因(HMG1)mRNA全长序列,其开放阅读框包含579nt,翻译成193个氨基酸.不同倍性鲫鲂HMG1的cDNA和氨基酸序列比较分析表明:在cDNA水平上,四倍体鲫鲂与母本红鲫的同源性(99%)高于同父本团头鲂的同源性(97%);三倍体鲫鲂与父母本同源性(95%)低于亲本之间的同源性(98%);在氨基酸水平上,四倍体鲫鲂与父母本的同源性(100%)高于三倍体鲫鲂与亲本的同源性(97%).结果表明:远源物种间的杂交对两性不育的三倍体鲫鲂HMG1基因造成了一定的冲击,分子遗传效应表现为三倍体鲫鲂HMG1基因位点发生了变异;四倍体鲫鲂HMG1氨基酸序列与亲本的完全一致性,克服了等位基因的杂交不亲和性,为两性可育的异源四倍体鲫鲂遗传稳定奠定了基础.生物信息学分析表明:HMG1蛋白二级结构具有8个螺旋和3个转角,HMG1蛋白三级结构于N-端具有两个DNA结合基序,C-端具有一长为23个重复D或E的氨基酸尾.这种结构决定了HMG1能够与核DNA发生"蛋白-DNA"的相互作用,参与多种核内生物学功能的完成.另外,以HMG1氨基酸序列构建了鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的进化树,结果提示HMG1是一种古老的蛋白质,并在物种演化中具有保守性;首次构建了鱼类HMG1原核表达载体,外源的鱼类HMG1基因编码蛋白在原核细胞中得到了表达,这为下一步HMG1蛋白的制备和生物学功能、尤其与DNA转座子相互作用的研究提供了条件,将助于了解物种间的杂交形成异源多倍体的机制.     

用团头鲂精子诱导红鲫雌核发育的研究

用遗传失活的团头鲂（Megalobrama amblycephala）的精子诱导红鲫（Carassius auratus Red Variety）进行雌核发育的研究. 红鲫的卵子经适宜UV剂量灭活处理的团头鲂精子激活后，在0—4℃下冷休克40min抑制第二极体的排出使染色体加倍，获得雌核发育红鲫. 它们的受精率、孵化率及成活率分别为（52.6±3.0）%，（23.6±4.1）%和（15.7±3.4）%，其成活率明显高于用鲤鱼精子诱导红鲫雌核发育的成活率（11.3±2.2）%. 以外形特征、染色体数目及性腺发育程度为依据对雌核发育红鲫与对照杂交鱼进行了区分和鉴定，结果表明，Ⅰ龄鱼的体色为红色，染色体数目为100，性腺发育正常的个体为成功的雌核发育红鲫；而染色体数目为124或148，性腺发育滞后的个体为杂交鱼，其中三倍体鲫鲂是不育的（2年观察证明），而四倍体鲫鲂2年才能达到性成熟. 以鲤鱼的精子作为对照，着重讨论了团头鲂精子作为刺激源的优势，即能提高雌核发育鱼的成活率，并可简化对雌核发育鱼的鉴定，研究证明团头鲂的精子是一种非常有效的诱导鲫鱼进行雌核发育的刺激源.     

不同倍性鲫鲤鱼血液及血细胞的比较

对异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和二倍体红鲫血液指标(红细胞数、血红蛋白值、红细胞脆性、比容)、细胞大小(红细胞及细胞核、白细胞、血栓细胞的长、短径值)及它们的显微结构进行了比较研究,并观察了四倍体鲫鲤血细胞亚显微结构.结果表明:在不同倍性鱼中,四倍体、三倍体、二倍体红细胞在数目、脆性、比容方面随倍性的降低而依次升高;血红蛋白无显著差异;在细胞大小上,四倍体、三倍体、二倍体的红细胞及细胞核、嗜中性粒细胞、单核细胞表现出4∶3∶2的比例关系;在红细胞的形态方面,异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫存在明显差异.同时发现随着倍性的升高红细胞的短径/长径比值减小.在异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫外周血中,均可观察到红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血栓细胞,未发现嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞.但三倍体湘云鲫、二倍体红鲫的嗜中性粒细胞仅有Ⅱ,Ⅲ两种类型,未见含深紫红色颗粒的Ⅰ型嗜中性粒细胞.对不同倍性鱼在血液细胞中出现的共同性和差异性进行了讨论分析.     

新型三倍体鲫鱼—红鲫(♀)×四倍体鲫鲤(♂)

四倍体鲫鲤与二倍体红鲫交配形成了新型三倍体鲫鱼，该三倍体鲫鱼的体侧扁，近似纺锤形，体色为青灰色，无口须.它们的大部分可量比例性状和可数性状都介于父母本之间，并且一些可量比例性状超出亲本范围，体现出杂种特征.第一年养殖结果表明，把同规格三倍体鲫鱼和二倍体红鲫混养，三倍体鲫鱼生长速度比红鲫快11.11%.性腺观察结果表明三倍体鱼的性腺发育比普通二倍体鱼明显滞后，生殖细胞呈退化现象.与以前用四倍体鲫鲤和日本白鲫交配形成的三倍体湘云鲫相比，三倍体鲫鱼不但保持了生长速度快、不育的特点，而且表现出完全没有口须的鲫鱼类型的特征，这在细胞遗传和鱼类育种方面都具有重要意义.     

基于DNA含量的复合鲫倍性分析

通过对复合鲫血细胞DNA含量的测定,探讨了其倍性和产生机制等方面的问题.结果显示,复合鲫的DNA含量明显多于母本种彭泽鲫的DNA含量,且所测14尾中多数个体的DNA含量超过或接近四倍体的DNA含量,少数个体的DNA含量介于三倍体和四倍体之间.推测多数复合鲫个体为复合四倍体异育彭泽鲫,其染色体组包含母本彭泽鲫的全套染色体和父本单倍染色体组所产生的子代,少数个体可能为非整倍体.     

人工四倍体鲤鲫的产生

在人工诱导的复合三倍体鲤鱼成熟个体中有极个别个体产出的卵既保留了原有的３套染色体,又能与一套外来精核融合产生四倍体。１９９７年人工产生的８０００多尾鲤鲫四位体鱼经细胞遗传学研究分析鉴定,结果所有的个体都有４套染色体组,染色体数目在１８５￣２１０之间,众数为２００,四位体比率为１００％,这表明人工复合三倍体鲤鱼的生殖方式十分独特,绝大部分个体的成熟卵可借助于外来精子的流动进行自然雌核发育;而有极个别     

暗纹东方鲀线粒体ATPase8和ATPase6基因的克隆与序列分析

克隆并测定了暗纹东方鲍（Takifugu fasciatus）线粒体ATP合酶Fo亚基8（ATPase8）和亚基6（ATPase6）的序列,并对其进行了初步分析。结果表明：PCR扩增产物的总长度为923bp,其中842bp为ATP8和ATP6基因的编码区。ATP8基因长168bp,编码55个氨基酸残基的蛋白质,其蛋白分子质量为6．8KD,等电点为7．85;ATP6基因长684bp,编码227个氨基酸残基的蛋白质,其蛋白分子质量为24．9KD,等电点为9．16。暗纹东方纯ATP合酶Fo亚基8和亚基6与其他已报道的部分东方纯属鱼类具有很高的同源性。通过探讨ATP合酶F0亚基所含的信息量,发现相对于其他线粒体基因,ATPase8和ATPase6基因所含鉴别信息较少。     

异源四倍体鲫鲤Sox9a基因保守区序列的克隆及内含子剪接位点分析

用特异于HMG-box保守区的兼并引物扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本(红鲫和鲤鱼)的Sox基因. 异源四倍体鲫鲤的扩增产物共有4条带,大小分别约为200,600,900和 1900?bp,而其原始亲本的扩增产物只有3条带,且在雌雄个体中未发现性别特异扩增带. 回收雄性四倍体鱼600?bp扩增带,经亚克隆及测序分析得到一个新的编码71个氨基酸残基的基因. 该基因与虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)、蟾蜍(Xenopus laevis)、鲤鱼(Cyprinus carpio)等的Sox9基因相似性达97%,据此命名为Atsox9a. 通过计算机分析和RT-PCR方法确定该基因含有内含子,并获得其内含子的序列和剪切位点,此内含子剪切位点在进化上是保守的. Atsox9a对于研究异源四倍体鲫鲤性别决定和分化机制及脊椎动物性别进化具有重要的理论意义.     

微卫星标记预警实验红鲫对苯酚遗传毒性响应的研究

摘要: 目的探讨微卫星标记预警实验红鲫对苯酚遗传毒性的响应。方法选择5 个微卫星标记,观察4 个苯酚 染毒组经8 d 染毒实验,苯酚对实验红鲫C1HD 系微卫星多态性的影响。结果苯酚在实验红鲫C1HD 系体内的 富集提高了基因杂合度( H) 、基因多态性信息含量( PIC) 等群体遗传学指数。在1 /8 LC50苯酚浓度组染毒第6 天,基因杂合度( H = 0. 15 ± 0. 19) 和基因多态性信息含量( PIC = 0. 42) 均达到峰值。结论体内富集一定浓度的苯酚可致实验红鲫C1HD 系微卫星多态性改变。微卫星基因杂合度( H) 和多态性信息含量( PIC) 随苯酚染毒时间的延长和富集量的增加而升高。     

饲料中添加酵母多糖对丰产鲫的影响研究

对在饲料中添加酵母多糖对丰产鲫(Fertility crucian)生长状况及抗病力的影响进行了初步的研究,饲料中添加0．5％和0．8％的酵母多糖,投喂35d,其结果：第一次试验丰产鲫的体长、体重和细菌感染后的存活率分别比对照组提高了5．02％、26．71％、20％和7．57％、28．73％、20％;第二次试验丰产鲫的体长、体重和细菌感染后的存活率分别比对照组提高了7．58％、35．00％、30％和11．90％、40．92％、30％,说明在饲料中添加酵母多糖对丰产鲫的生长有促进作用,同时增强了丰产鲫的抗病力。     

三种化学诱导剂诱导太平洋牡蛎三倍体的比较研究

从三倍体率,D幼孵化率,幼虫生长速度,生长成本等方面比较了细胞松弛素B,二甲基氨基嘌呤,咖啡因三种化学诱导剂诱导太平洋特蛎产生三倍体的效果,CB的三倍诱导率最高,为91．5％,但D幼孵化离最,仅为5．8％,且成本最高,为6－DMAP和咖啡因的4倍和50倍,6－DMAP的三倍体诱导率略低于CB,为88．0％,但D幼孵化率最高,为60．5％,其成本仅为CB的1／4,咖啡因的三倍体诱导率最低,为82．4％,幼虫孵化率为30．2％,但其成本最低,仅为CB的2％和6－DMAP的8％,三种诱导剂诱导的三倍体群幼虫在生长速度及成活率方面无显著差异。     

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本Sox9基因HMG保守区内含子遗传变异性分析

参照不同物种中Sox基因HMG保守区序列设计简并引物,扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫(Carassius carassiusred var.)和鲤鱼(Cyprinus carpioL.)的Sox基因.对不同片段大小的Sox基因测序,结果表明,四倍体鱼中存在两个Sox9基因(Atsox9a和Atsox9b),红鲫和鲤鱼中只发现一个Sox9基因(Rcsox9a和Ccsox9b).这4个Sox9基因在HMG盒中均含有内含子,大小分别为413bp,703bp,401bp和714bp,其插入位点遵守GT-AG法则.其中Atsox9a与Rcsox9a,Atsox9b与Ccsox9b的内含子序列都具有很高的一致性,分别为94.4%和97.8%,这表明内含子序列变异率较低.有趣的是,根据它们的外显子所推导的氨基酸序列一致性均为100%.因此,四倍体鱼及其原始亲本Sox9基因HMG基序内含子不仅具有长度多态性,而且内含子之间存在遗传变异性,这为进一步探讨异源四倍体鲫鲤的起源和进化提供了重要的分子生物学证据,同时也为正确掌握内含子的位置信息,功能和进化起源有着十分重要的作用.     

人工四倍体鲤鲫成熟卵受精过程的扫描电子显微镜观察

以人工四倍体鲤鲫卵子和普通红鲤精子为材料进行人工受精，在受精后的不同时间以扫描电子显微镜观察卵子对精子的应答反应、受精孔形态、数量与大小以及受精过程等超微结构特征. 结果表明，四倍体卵子动物极的卵壳上仅有一个受精孔,但受精孔区域有5—6个似小山丘状的嵴状结构，而鲤却完全没有这种结构. 研究证实：四倍体鲤鲫成熟卵属单受精孔、单精受精类型，其特异的嵴状形态结构可作为区分普通鲤的标记表型.     

红树植物老鼠筋多糖的提取和初步纯化的研究

对老鼠鲂多糖的提取和初步纯化工艺进行了研究，通过探讨料液比、提取时间、提取温度和提取次数对老鼠鲂多糖提取率的影响，并在单因素的基础上进行正交试验来确定最佳提取条件．结果表明：提取多糖最佳条件未料液比（树枝：水）为1：35，90℃水浴提取3h，提取次数为3次，多糖提取率达到1．14％．使用不同树脂（D001，D301，D201，ADS-8）对老鼠筋粗多糖进行初步纯化，结果表明D301脱色脱蛋白效果最好，并可将纯度提高到35．6％．     

稀有鮈鲫--一种新的鱼类实验动物

鱼类作为低等脊椎动物的代表和水生态系统的代表 ,具有繁育力强、体外受精、体外发育、胚体透明等特点 ,过去一直是胚胎学、遗传学、水毒理学、行为科学、环境科学等领域常用的材料。自从Streisinger关于斑马鱼人工雌核发育及纯系建立的文章在Nature上发表后 ,以斑马鱼、青为代表的鱼类很快成为了实验动物的“新宠” ,并在发育遗传学、环境科学领域的研究中扮演了越来越重要的角色。我国从 2 0世纪 90年代开始先后进行了稀有鲫、剑尾鱼、红鲫等鱼类的实验动物化研究 ,并于 2 0 0 1年成立了中国实验动物学会水生实验动物专业委员会。稀…     

稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因 cDNA 克隆及组织表达分析

铜蓝蛋白(Ceruloplasmin,Cp)是一种重要的铜转运蛋白,合成于肝脏并参与生物体铁的代谢,在医学上是各种炎症、感染、中毒及癌症疾病的标志性蛋白.铜蓝蛋白的研究已在多种真骨鱼类中被报道,文中第一次在稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)中报道此基因.采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因,使用荧光定量PCR的方法构建了该基因组织表达谱.序列分析表明稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因包含3 264bp全长编码序列,该序列编码1 087个氨基酸,其核苷酸和氨基酸序列与斑马鱼同源性最高(分别为88.1%和90.3%).理论相对分子质量和等电点分别为124 429.1D和6.41.荧光定量PCR检测表明该基因在肝脏和脾脏中相对表达量最高,在肌肉和鳃中相对表达量最低.使用氨基酸序列进行蛋白结构保守域分析,结果表明铜蓝蛋白基因在脊椎动物中是相对保守的,推测其功能也与其他物种相似.这为进一步研究稀有鮈鲫该基因的功能及其应用奠定了基础.     

稀有鮈鲫β-肌动蛋白基因片段的克隆及其同源性分析

采用RT-PCR方法,从稀有鮈鲫肌肉组织中分离和克隆出β-肌动蛋白基因cDNA部分序列,长度为1029bp,编码343个氨基酸残基．序列分析表明,该cDNA序列与其他物种昏肌动蛋白基因同源性非常高．RT-PCR能够检出该基因在稀有鮈鲫肌肉、眼、脑、心脏、肝、肠、鳃、睥、卵巢等组织中广普表达,在胚胎不同发育时期持续恒量表达．并基于已知的鱼类β-肌动蛋白基因序列构建了进化树．