Construction of Eukaryotic Expression Vector of Human PSF and Identification of its Expression in CHO Cell Line

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况.应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFPNL真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定.将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达.成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达.     

拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白的亚细胞定位

为确定拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan-protein,AGP)的亚细胞定位,克隆了这个基因的编码区,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建融合表达载体,经农杆菌介导转化烟草BY-2悬浮细胞.利用激光扫描共聚焦显微镜,在稳定转化的BY-2细胞表面观察到绿色荧光.研究结果表明,此AGP分布在细胞膜表面.     

EGFP和ALR融合基因表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

从人血液中提取总DNA,利用PCR技术扩增人肝细胞再生增生因子基因,将其插入表达载体pEGFP—C1的多克隆位点中,构建增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein gene,EGFP）和人肝细胞再生增强因子（human augmenter of liver regeneration gene,ALR）融合基因表达载体pEGFP／ALR,并将其转染Hela细胞系,用含G418的DMEM／F12培养液筛选转基因细胞,然后利用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测转基因细胞中ALR基因的存在及其表达,用荧光显微镜检测EGFP基因的表达．结果显示：得到了构建正确的EGFP和ALR融合基因表达载体;在转基因细胞中,PCR扩增得到1．7Kb的ALR条带,蛋白电泳得到57KD大小条带．与ALR和EGFP融合蛋白大小相符;荧光显微镜下观察到发绿色荧光的Hela细胞．在转基因细胞中,EGFP和ALR同时存在并表达,绿色荧光蛋白可作为报告基因指示目的基因的表达,从而简化了目的基因繁琐的检测手段．     

小鼠T细胞发育相关基因RS21-C6的表达谱及其编码蛋白的细胞内定位

研究了小鼠T细胞发育相关基因RS21-C6的表达谱及其在细胞内的定位.提取小鼠8种组织及处于5个发育阶段的胸腺细胞总RNA,逆转录成cDNA后,利用RS21-C6基因特异性引物,观察了RS21-C6基因的表达;同时构建pEGFP-N3/RS21-C6重组表达载体,在激光共聚焦荧光显微镜下观察了细胞内荧光分布.RT-PCR结果表明RS21-C6基因在所检测的组织和细胞中除骨骼肌和CD4SP胸腺亚群外均有不同程度的表达.激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明,RS21-C6-GFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白表达在胞浆内,RS21-C6-GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果.     

LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达及定位,通过基因重组的方法构建LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体,并通过酶切和基因测序鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。经酶切和基因测序鉴定LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功。转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达。说明基因重组技术可成功构建LMP3／pEGFP-N3重组体真核表达载体,重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内。     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。     

EGFP-IgG4融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）和IgG4基因的融合蛋白真核表达载体pMM-EGFP-IgG4/WG,转染至中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)中成功表达,并发出绿色荧光,证明pMM-EGFP-IgG4/WG是一种良好的生产分泌型外源融合蛋白的阳性对照.     

动力蛋白轻链亚基LC8在人细胞内的亚细胞定位

动力蛋白是活跃于微管骨架上行使负向运输功能的分子马达.从人类B淋巴细胞cDNA文库中克隆得到动力蛋白轻链亚基的基因LC8,将该基因插入表达绿色荧光蛋白的载体pEGFP-C3,获得的重组DNA成功在两种人源细胞内表达.通过荧光实验对GFP-LC8亚细胞定位进行分析,确定GFP-LC8是典型细胞浆定位,主要分布在细胞外周区和微管组织中心附近.当用药物nocodazole处理细胞使微管解聚时,GFP-LC8的定位发生改变.表明融合蛋白可正确指示LC8的细胞定位,可用于进一步研究病毒感染后的胞内事件.     

靶向survivin基因的shRNA慢病毒载体的构建及其对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.     

含Syntaxin 1A基因的SFV表达载体的构建与表达

用绿色荧光蛋白 (EGFP)标记了Syntaxin 1A(Syn1A)蛋白 ,构建了含有EGFP Syn1A融合蛋白的森林脑炎病毒表达载体 pSFV1 EGFP Syn1A ,测序结果表明表达载体构建正确 .用荧光显微成像技术研究了Syn1A在原代大鼠胰腺 β细胞中的定位 ,结果表明Syn1A主要定位于细胞质膜上 .     

Prokaryotic expression and characterization of a pea actin isoform （PEAcl） fused to GFP

Actins widely exist in eukaryotic cells and play important roles in many living activities. As there are many kinds of actin isoforms in plant cells,it is difficult to purifyeach actin isoform in sufficient quantities for analysing itsphysicochemical properties. In the present study, apea(pisum Sativum L.)actin isoform (PEAc1)fused to His-tag at its amino terminus and GFP(green fluorescent protein)atits Carboxyl terminus were expressed in E. coli in inclusionbodies. The fusion protein (PEAc1-GFP)was highly purifiedwith the yield of above 2 mg/L culture by dissolving inclu-sions in 8 mol/L urea,renaturing by dialysis in a gradient of urea,and affinity binding to Ni-resin. The purified mono-meric PEAc1-GFP could efficiently bind on DNase I andinhibit the latter抯 enzyme activity. PEAc1-GFP could po-lymerise into green fluorescent filamentous structures(F-PEAc1-GFP),which could be labelled byTRITC-phalloidin,a specific agent for observing microfila-ments. The PEAc1-GFP polymerlzation curve was identicalwith that of chicken skeletal muscle actin. The critical con-centration for PEAc1-Gfp to polymerise into filaments is 0.24 μmol/L.The F-PEAc1-GFP could stimulate myosinMg-ATPase activity in a protein concentration dependantmanner (about 4 folds at 1 mg/mL F-PEAc1-GFP). The re-sults above show that the PEAc1 fused to GFP retained theassembly characteristic of actin, indicating that gene fusion,prokaryotic expression, denaturation and renaturation,andaffinity chromatography is a useful strategy for obtainingplant actin isoform proteins in a large amount.     

使用差异定位SunTag组件实现对细胞质内高含量蛋白的活细胞观察

生物过程由数百万个蛋白质驱动.蛋白质结构和蛋白质定位是蛋白质行使功能的关键.在过去的研究中,快速发展的荧光显微镜成像技术使研究人员可以直接观察蛋白质在活细胞内的定位.然而,对细胞质内高含量蛋白的活细胞观察仍然存在技术障碍.我们通过改进SunTag标记技术,使用差异定位的SunTag组件:一方面,在研究目的蛋白(POI)上标记多个V4抗原;另一方面,将识别V4抗原的抗体GCN4融合的绿色荧光蛋白(GCN4-GFP)通过差异定位后限制其与抗原的结合量.我们的方法大大降低了背景荧光信号,实现了对dynamin膜上功能单位的直接可视化.     

活体烟草BY-2悬浮细胞微丝骨架的标记

微丝骨架是细胞骨架的重要成员,在细胞的多项生理活动中发挥着重要作用.本论文利用荧光标记鬼笔环肽技术和GFP融合蛋白技术,对活体烟草BY-2悬浮细胞中微丝骨架的标记方法进行了探索,结果表明,10nmol/L的Alexa488-Phalloidin为细胞微丝骨架标记的最佳浓度,利用PCR等技术构建pPZP-NtFABD2-GFP植物表达载体后,转化烟草BY-2悬浮细胞,激光共聚焦扫描显微镜观察发现,NtFABD2-GFP融合蛋白能够清晰地显示活体烟草悬浮细胞内的微丝骨架.这些结果为进一步深入研究微丝骨架在活体植物细胞中的功能奠定了基础.     

绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri的构建及鉴定

构建表达重组绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-c1-hri,为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用机制打下基础.用亚克隆法,将目的片段egfp-c1-hri从表达载体pEGFP-C1-hri克隆到pLNCX上,用酶切筛选得到阳性克隆后,用脂质体法将其转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,用800 mg/L G418筛选2周后,在荧光显微镜下检测其表达.双酶切鉴定得到pLNCX-EGFP-C1-hri阳性克隆,荧光显微镜显示绿色荧光在B16细胞质中高效表达.成功构建逆转录病毒表达载体pLNCX-EGFP-C1-hri.     

生长素调控极性运输载体PIN2质膜丰度与降解

主要观察了外源生长素长时间(8 h)处理对拟南芥生长素极性输出载体PIN2-GFP质膜丰度的影响,低温、KCN处理和生长素受体突变对生长素调控质膜PIN2-GFP丰度的影响,以及液泡H+-ATPase抑制剂ConA对野生型和生长素受体四突变体tir1afb1,2,3液泡中PIN2-GFP积累的影响.结果表明:外源生长素通过其受体TIR1/AFB介导的信号途径下调质膜PIN2-GFP的丰度,促进PIN2-GFP的内吞、胞内运输和液泡降解.暗示生长素通过TIR1/AFB介导的信号途径反馈调控质膜PIN2-GFP的水平,从而阻止了胞内生长素的过多输出.     

Functional analysis of the ABA-responsive protein family in ABA and stress signal transduction in Arabidopsis

The phytohormone abscisic acid (ABA) plays an important role in plant growth and development, for example in seed dormancy and germination, as well as in plant responses to environmental stresses, such as drought and high salinity. Previous studies have shown that ABA regulates the expression of genes with an ABA-responsive element (ABRE) and their corresponding physiological responses. Bioinformatics analysis identified a GRAM domain-containing gene family that has a multiple ABRE cis-element, which was termed the ABA-responsive protein (ABR) family. To analyze the function of the ABR family, we identified homozygous T-DNA insertion mutants and constructed abr1, 2, 3 double mutants and triple mutant. The abr1, abr2 and abr3 single mutants showed a normal phenotype; however, the germination of seeds of the double mutants and triple mutant were insensitive to ABA, NaCl, mannitol and glucose. ABR1-GFP was distributed as a punctate structure in the cytosol and may be localized in the endomembrane system. The ABR2-GFP and ABR3-GFP proteins localized in the cytoplasm. In addition, ABR1, ABR2 and ABR3 were expressed in various tissues, and could be induced by several abiotic stresses, especially by ABA. The expressions of these genes were significantly suppressed in aba2, abi1 and abi2 null mutants. These results suggested that the ABR family may act downstream of ABI1 and ABI2 in the ABA signal transduction process in plants.