重组纤溶酶原激活剂及其突变体的表达研究

利用PCR技术 ,获得了人体组织型纤溶酶原激活剂tPAcDNA的缺失突变体———rPA ;在此基础上 ,运用定点突变技术 ,得到rPA的定点突变体———rPA(KHRR2 96～ 2 99AAAA) ,rPA(A473S)和二者的复合突变体rPA(KHRR2 96～2 99AAAA A473S) ;将rPA及其 3个突变体分别亚克隆至原核表达载体pET 2 8a( )中 ,获得表达载体pErA ,pErA(K) ,pErA(A)和pErA(KA) .酶切鉴定和序列分析结果均表明实现了实验设计的氨基酸突变 .表达载体转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导、菌体裂解及SDS PAGE电泳分析发现 ,只缺失而无突变的pErA和突变的pErA(A)都未表达目的蛋白 ,突变体pErA(K)与pErA(KA)则获高水平表达 ;蛋白产量分别占菌体总蛋白的 35 .97%与 37.71% ,分子量均为 39.6kD .Westernblotting显示 ,表达产物与抗tPA抗体呈特异性阳性反应 .该产物经初步纯化后进行复性与活性 (mFAPA)测定 ,结果表明其复性产物具有明显的体外纤溶活性 .以上结果为rPA突变体的进一步纯化、体内活性研究以及规模化制备提供了基础     

pMAL-p2X系统表达SLA-Ⅰ复合体蛋白

SLA-Ⅰ/pMAL-p2X为人工构建的原核表达体系.为获取最佳表达的SLA-Ⅰ复合体蛋白及其可溶性表达含量,设计实验对其进行表达优化(pH值、温度、菌体密度、IPTG浓度、诱导时间),SDS-PAGE检查目的蛋白的表达.另外检查目的蛋白的可溶性表达含量.结果显示,SLA-Ⅰ在pMAL-p2X的最佳表达条件为pH=8.0、T(温度)=37 ℃、OD600=1.0、IPTG=0.4 mmol/L和t(诱导时间)=5 h;证明目的蛋白可溶性表达含量占总表达蛋白的70%左右.研究表明pMAL-p2X系统适合于生产可溶性的SLA-Ⅰ复合体蛋白,便于今后进一步研究SLA-Ⅰ类分子结构和功能.     

致病性鸡大肠杆菌pilA和外膜蛋白C原核诱导表达条件的优化

分别从温度、接菌量、诱导时机、IPTG浓度、诱导时间等条件对2种重组菌株BL21/pET - 28a - pilA和BL21/pET - 28a - ompC进行优化.得到最佳诱导条件:BL21/pET - 28a - pilA菌株为40℃摇培,80μL的接菌量,160r/min摇培2h后加入终浓度为0.96mmol/L的IPTG,再诱导表达4h,得到最高特异蛋白表达量;BL21/pET - 28a - ompC菌株为37℃培养,80μL的接菌量,160r/min摇培2.5h后加入终浓度为0.64mmol/L的IPTG,再诱导表达6h,得到最高特异蛋白表达量.     

基因重组鲨鱼软骨血管生成抑制因子的发酵条件优化

采用三角摇瓶来优化基因工程菌表达重组鲨鱼软骨血管生成抑制因子(SCAIF)的最佳发酵条件,并以此为基础在Biotop CF-10L自动控制发酵罐进行发酵培养.基因工程菌BL21(DE3)/pET3c(SCAIF)诱导表达SCAIF蛋白的最佳摇瓶培养条件是:接种量为2%、装液量为75 mL/500 mL、加入IPTG的诱导时间为培养2 h后、IPTG浓度为0.25 mmol/L、诱导时间为2 h.BL21(DE3)/pET3c(SCAIF)菌种在Biotop CF-10L自动控制发酵罐中的条件为:以10%的接种量接种到10 L发酵培养基中,设定pH 7.0,温度37℃,培养4 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导2 h后终止发酵.发酵罐中获得的菌体量为10.2 g/L,蛋白表达率为25%左右.     

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843 bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%.将CP基因定向插入EcoR I/SalI切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为37 kD的CP蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4 h后蛋白开始表达,8 h后表达量比较大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与CP发生血清学反应.     

重组毕赤酵母表达reteplase发酵过程中的降解现象

研究了pH和温度对重组毕赤酵母表达retep lase(rPA)发酵过程中的降解现象。在低pH(4.5)诱导条件下,由于蛋白酶活性高,rPA降解严重,表达量几乎为0,提高诱导pH至6.5,蛋白酶活性降低,rPA的表达量最高达到122 m g/L。通过将诱导温度从30°C降低到20°C,rPA的表达量从153.2 m g/L提高到207.9 m g/L。降低温度能减少细胞死亡率,从而减少了发酵液中蛋白酶的释放,降低了蛋白酶的活性,抑制了对目的蛋白rPA的降解。另外,低温使胞内AOX酶活性提高,从而增强了rPA的表达。     

rPA(K)原核表达产物的复性与纯化

为探索新型rPA(K)在原核系统中表达产物的纯化和复性,采用不同的洗涤剂(脲、Triton X - 100、乙醇)依次洗涤包涵体,又经硫酸铵沉淀,得到了经初纯后纯度较高的包涵体.结果表明,经2mol/L脲、1mL/L Triton X - 100、200mL/L乙醇洗涤,15%饱和度的硫酸铵沉淀后,包涵体的纯度由16.0% 提高到56.6%.在此基础上,利用稀释复性和透析复性2种方法对包涵体进行复性,以恢复产物的天然构象,获得具有生物学活性的目的蛋白.结果如下:采用透析复性法,rPA(K)的比活可达1.33×105IU/mg;采用稀释复性法,rPA(K)的比活可达1.06×105IU/mg.利用S·TagTM rEK纯化试剂盒对目的产物进行进一步纯化,并对rEK和MgCl22种洗脱剂的洗脱效果进行了比较.SDS - PAGE结果显示,MgCl2洗脱后的产物,分子量未发生变化,仍为43ku,其纯度为72%;而rEK洗脱后的产物,其纯度达到了72%,且分子量减小至约40ku,表明去除了融合蛋白中的非目的片段.     

大肠杆菌表达高性能融合鱿鱼环齿-类弹性蛋白的发酵优化

为了实现重组蛋白SRT-ELP36在大肠杆菌中的高效表达,利用携带重组蛋白SRTELP36基因的pET-25b(+)表达载体,分别在摇瓶和5 L发酵罐上进行了发酵条件优化,并在50 L发酵罐中进行放大验证。经转化表达质粒后,宿主菌BL21(DE3)的菌体生长和蛋白体积产量均高于BLR(DE3),可用于蛋白SRT-ELP36表达。摇瓶发酵条件优化结果表明,TB(Terrific Broth)培养基、装液比(装液量与摇瓶体积之比)为5%、诱导温度为37℃、对数生长结束期添加0.5 mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂,菌体最高OD₆₀₀(波长600 nm处的吸光值)达到22.3,最高蛋白体积产量达0.60 g/L。在5 L发酵罐中进行补料分批培养条件优化,在OD₆₀₀为35时添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG启动诱导,并控制过程菌体氧消耗速率(OUR)为(180±5) mmol/(L·h),菌体的最高OD₆₀₀和蛋白体积产量分别达到了88、1.85 g/L,单位菌体蛋白产量为70 mg/g。在...     

西瓜花叶病毒HC-Pro基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物HC-Pro基因,大小为1 371 bp.将HC-Pro基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与其它国家HC-Pro核苷酸同源性为90.7%~94.8%.将HC-Pro基因定向插入EcoR I/Sal I切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WHC,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为57 kD的HC-Pro蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 2 h后蛋白开始表达,继续诱导到8h后表达量变化不大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了HC-Pro蛋白的抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与HC-Pro发生血清学反应.     

坛紫菜别藻蓝蛋白β亚基的表达及鉴定

根据GenBank(AY372218)中的相关序列设计引物,通过PCR的方法从质粒pMD-apcAB中扩增坛紫菜别藻蓝蛋白β亚基基因(apcB),并将其克隆到高效表达外源基因的原核表达质粒pTO-T7.将构建好的质粒导入表达型大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并对表达产物进行Western-blot和质谱鉴定.结果显示:apcB全长486 bp,表达的坛紫菜别藻蓝蛋白β亚基(APCβ)为带有原核表达载体T7g10的12个起始氨基酸的融合蛋白,其分子量约为18.0 ku.扫描分析的结果表明,0.5 mmol/L的IPTG在37℃诱导6 h时,APCβ的表达量达到最大,达菌体总蛋白40%以上.Western-blot和质谱鉴定的结果表明获得的融合蛋白为重组坛紫菜别藻蓝蛋白β亚基.