Cloning and sequence analysis of VP2 gene of infections bursal disease virus

用SPF鸡胚成纤维细胞繁殖鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV) J1C7毒株.用纯化的病毒颗粒提取RNA基因组.根据已报道的IBDV JD1株的VP2序列设计引物,利用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)进行扩增,将获得的1359 bp片段克隆于pMD 18-T载体上.经过限制性酶切及PCR鉴定后,得到阳性重组质粒.对VP2基因进行全序列测定表明,克隆的VP2基因长1359 bp,编码452个氨基酸.J1C7株VP2蛋白高变区内两个亲水区与其他标准Ⅰ型毒株完全相同,而且具有弱毒疫苗株的特征性氨基酸:222P、256V、279N、284T、294L、299N,七肽区的氨基酸序列为SWS ARGS,因此,从分子水平上推断本研究的J1C7株为标准Ⅰ型毒株,且属于弱毒疫苗株.与已报道的IBDV VP2基因的氨基酸序列进行比对,结果表明,本研究的J1C7株与来自欧洲和中国的弱毒疫苗株有密切的亲缘关系.     

日本白鲫生长激素-Ⅱ基因编码区cDNA的克隆及序列分析

采用反转录．聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从日本白鲫脑垂体总RNA中扩增出生长激素-Ⅱ(GHⅡ)编码区cDNA，克隆到Pum-T载体上进行序列测定和分析．结果表明，克隆的cDNA的开放阅读框长度为630bp，其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽．与得到的生长激素-Ⅰ(GHⅠ)的碱基序列和推测的氨基酸序列相比，同源性分别达到96．9％和98．5％．白鲫的GHⅠ的碱基序列和推测的氨基酸序列与国外已发表的金鱼GHⅠ比较，同源性分别为98．7％和100％，白鲫和金鱼的GHⅡ碱基序列和推测的氨基酸序列同源性分别为95．7％和95．2％．     

日本白鲫生长激素-I基因编码区cDNA的克隆

从日本白鲫(carassius cuvieri)脑下垂体中提取总RNA，采用逆转录PCR法扩增出日本白鲫生长激素—Ⅰ cDNA编码区，克隆到Pucm-T载体上，序列测定表明日本白鲫生长激素—Ⅰ基因的开放阅读框含有630bp，其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽，日本白鲫生长激素—Ⅰ基因的克隆成功为该基因的功能及应用研究奠定了基础。     

鳜肌球蛋白轻链2基因cDNA的克隆及其发育表达分析

通过构建肌肉组织cDNA文库分离到鳜肌球蛋白轻链2基因(MLC2),基因登录号为FJ428249.MLC2基因cDNA序列全长1 206 bp,编码区长度为579 bp.MLC2基因开放阅读框编码170个氨基酸,具有EF-手相家族蛋白全部4个EF-手相结构.与已报道的其他动物MLC2相比较,所推导氨基酸序列同源性在66.3%～97.6%,其中与ca2+结合区域非常保守,7种鱼氨基酸序列同源性为100%.采用实时荧光定量PCR方法对鳜MLC2发育表达分析表明,MLC2在原肠期开始有低量表达,与原肠期相比,尾芽期、肌肉效应期和仔鱼阶段MLC2表达量随发育阶段渐进而升高.     

苏云金芽胞杆菌cry7Ab9基因的克隆与杀虫活性的测定

以辽宁省千山市的22株苏云金芽胞杆菌进行PCR cry型的cry7类基因鉴定,对cry7类基因进行克隆表达及生物活性测定,为cry基因储备奠定基础.菌株QZG121经比对后发现含有cry7Ab基因.克隆该基因全长序列为3 417 bp,编码1 138个氨基酸残基,相对分子质量为130 000,并在Gene Bank中登记,基因登录号为GU936713,由苏云金芽胞杆菌国际命名委员会正式命名为cry7Ab9.通过构建原核表达系统获得cry7Ab9基因表达蛋白,并进行暗黑鳃金龟幼虫杀虫活性的测定,7天校正死亡率10 mg.L-1为11.11%、100 mg.L-1为25.93%;两周校正死亡率10 mg.L-1为33.33%、100 mg.L-1为48.15%,LC50为289.99 mg.L-1.     

麻疹病毒CC47疫苗测序分析及与其他A基因型病毒株比较

对长春-47(CC47)麻疹病毒减毒活疫苗即CC47疫苗进行测序分析,并与其他A基因型病毒株进行了比较。通过RT-PCR法扩增了6个编码基因,用双脱氧链终止法对产物进行自动测序。对结果进行比较分析发现,CC47疫苗有13个特有的氨基酸改变分别位于N,P和L蛋白,可以看做是该疫苗株的"疫苗标签"。通过构建系统发生树,分析了11株麻疹病毒的亲缘关系。本研究完善了CC47疫苗基因组信息,提供了对麻疹流行进行监测和对病毒减毒基因学基础进行进一步研究的潜在目标。     

金鱼胰岛素样生长因子2基因克隆与组织表达

采用PCR方法,扩增并克隆了金鱼的IGF2基因.序列分析结果显示:金鱼的IGF2基因共包括有4个外显子和3个内含子,开放阅读框长606 bp,编码201个氨基酸;编码序列与斑马鱼有85%一致性;蛋白质序列与斑马鱼的有80.9%的一致性.RT-PCR证明金鱼IGF2基因在鳃、心脏、肾、肌肉、尾鳍、雌雄性腺等组织中均有表达.     

人类新基因RMND5A的克隆及功能研究

克隆了一个新的人类Lish/CTLH结构域基因,经国际基因命名委员会批准命名为RMND5A.该基因位于染色体2p11.2,长3 239 bp,编码391个氨基酸,其结构域从N端起依次为LisH、CTLH与CRA.RT-PCR分析表明该基因在人类早期胚胎的多个组织中有表达,在心脏、肝和肾中的表达水平较强.对该基因的蛋白进行了表达并制备了多克隆抗体.荧光素酶活性测定分析表明,在COS7细胞中过表达蛋白可以使MAPK信号途径的两个下游转录因子ELK-1和AP-1的转录活性显著下降,表明RMND5A通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程.     

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)arom基因3′-末端的克隆与分析

根据五功能AROM蛋白保守区域设计简并引物,从核盘菌基因组中获得了一段大小为1626bp的DNA片段。结合Southern杂交结果,用反向PCR克隆了arom基因3′-末端4104bp的序列。序列分析结果表明,该DNA片段推测的氨基酸序列与烟曲霉、粗糙脉孢霉、构巢曲霉和粟酒裂殖酵母等的AROM蛋白同源,包含了部分5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶)结构域、莽草酸激酶结构域、脱氢奎尼酸脱水酶(脱氢奎尼酸酶)结构域和脱氢莽草酸脱氢酶结构域,其中含有EPSP合成酶模式2(255—273)、莽草酸激酶模式(426—453)和Ⅰ型脱氢奎尼酸酶活性位点模式(659-687)。     

新基因ZNF325在人类早期胚胎中的表达

锌指蛋白基因家族是人类最大的基因家族之一，目前已知的很多转录调控因子都是锌指蛋白成员^[1]。初步克隆了一个与RBAK基因有着高度同源性的人类C2H2型锌指蛋白新基因，经国际基因命名委员会批准命名为ZNF325，此基因位于染色体7p22，长2697个碱基，含5个外显子，在基因组DNA上长15kb。它编码的蛋白质全长462个氨基酸，含15个C2H2型的锌指。Northern Bolt分析表明该基因在人类早期胚胎的各个组织中普遍表达，在肺和脑中的表达水平最强，但在肝中的表达随着胚胎的发育而逐渐减少。它的结构和表达特征预示着它编码的是一个具DNA结合功能的转录调控因子。     

东北红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA克隆及其与紫杉醇产生菌基因组DNA的Southern杂交(英文)

为进一步研究紫杉二烯合成酶的作用机理和紫杉醇生物合成代谢调控机制,采用RT-PCR技术从东北红豆杉(Taxus cuspidata)树叶中获得了紫杉二烯合成酶基因片段,将该片段克隆在载体pGEMT-easy vector上,并转化到E.coliJM109中,经EcoRI酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定,获得紫杉二烯合成酶基因片段长度为909 bp,编码303个氨基酸,与GenBank中收录的紫杉二烯合成酶的同源性达到98%;对获得的紫杉二烯合成酶基因和紫杉醇产生菌HQD33基因组DNA进行了Southern杂交。结果初步证实了紫杉二烯合成酶存在于通过内生真菌发酵生产紫杉醇的生物合成途径中。为利用分子生物学手段研究通过内生真菌发酵生产紫杉醇生物合成的代谢调控和构建高产紫杉醇基因工程菌株提供了强有力的理论指导。     

人类新基因ZNF323研究初报

人的锌指蛋白是重要的转录抑制因子,运用计算机克隆的方法获得一个新的人类基因,被命名为ZNF323,该基因的cDNA全长2333bp,编码一个长209个氨基酸的多肽（分子量约为22kD),在肿瘤组织中高度表达,表明其可能与肿瘤的发生有关。     

人类新型锌指蛋白ANKZF1对AP-1信号途径抑制作用的研究

心脏发育是一个非常复杂的过程,受一系列基因的精确调控.研究表明,许多锌指蛋白参与心脏的形成和疾病的发生.为了鉴定新的与心脏发育有关的人类锌指基因,应用同源基因克隆法,通过PCR技术扩增获得了一个新的人类基因,其cDNA全长2 594 bp,编码由726个氨基酸残基组成的蛋白(相对分子质量约为80.9 kD).经国际人类基因命名委员会批准,被命名为ANKZF1.该基因是哺乳动物物种特有基因.RT-PCR分析表明,该基因在胚胎的心脏、胃、肾和脑组织中有特异性的表达,提示该基因可能与心脏等组织的发育有关.此外,通过报告基因分析发现,该基因对AP-1信号途径的转录活性有抑制作用.亚细胞定位分析表明该蛋白定位在细胞之中.     

DNAStar软件在动物病毒研究中的应用实例

利用DNAStar软件包中的Editseq软件将TGEV TH98株spike基因核苷酸序列翻译成氨基酸序列,然后利用Protean软件进行氨基酸序列分析,预测二级结构及B细胞抗原表位.结果表明,TGEV spike蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,含有较多潜在的B细胞抗原表位,包括43～56,97～104,117～128,132～173,238～257,391～398,535～706,779～799,918～987,1165～1200,1257～1266和1430～1446aa区段.     

利用接头插入技术构建环型T载体(pYCQ1)

人工设计接头序列,其特点为含有3′突出A末端,同时人工接头序列内部含有XcmⅠ、BspM901、AceⅡ酶切位点。利用人工接头3′突出A与线性的pMD18-T载体的3′突出T连接,将线性的pMD18-T载体改造成环形具有自身复制功能的pYCQ1载体,降低了实验室使用T载体的成本,同时增加了载体的克隆位点。利用pYCQ1作为T载体时,用XcmⅠ酶切(XcmⅠ限制性片段具有3′T末端)pYCQ1载体可以得到线性的3′T粘性末端的pYCQ1-T载体。实验验证,pYCQ1-T载体可以在受体菌E.coliDH5α中进行大量自我复制,并能够克隆1 800 bp的外源PCR产物。     

抗汞菌株的筛选及质粒的研究

测定了自污染地区分离到的抗30μg/mL HgCl_2的87株细菌中有39株具有质粒带,将它们分为4种类型,其中汞盐抗性质粒可以转移。其抗性不只是由质粒决定,还受核基因控制。探讨了对不同菌株的质粒进行消除的方法。