重组蓝细菌PsbF亚基形成 β∶β 同源二聚体细胞色素b-559

所有进行放氧光合作用的生物都具有两个光系统—— 光系统Ⅰ和光系统Ⅱ. 目前所分离到的最小的有光化学活性的光系统Ⅱ含3个亚基: D1, D2和细胞色素b-559. 细胞色素b-559在光系统Ⅱ中的作用至今不明. 利用基因重组方法, 将Synechococcus sp PCC7002的psbF基因以融合基因形式在大肠杆菌中高效表达, 获得有氧化还原活性的细胞色素b-559. 用凝血酶处理除去N末端谷胱甘肽氧化还原酶后获得的PsbF亚基仍有氧化还原活性, 说明PsbF可在大肠杆菌中形成二聚体. 不论是融合蛋白还是PsbF二聚体, 其氧化态吸收光谱、还原态吸收光谱和二者的差示光谱同分离到的高等植物细胞色素b-559光谱相同. 氧化还原滴定显示, 二者的氧化还原电位在50 mV左右. 上述结果对确定细胞色素b-559的亚基组成和蛋白在膜上的定位有很大帮助.     

TCA法去除放氧外周蛋白对PSⅡ放氧侧的影响

具有放氧活性的光系统Ⅱ(PSⅡ)膜颗粒主要由反应中心蛋白D1和D2、细胞色素b559、叶绿素结合蛋白CP47和CP43、分子量分别为17,23和33 ku的外周蛋白以及光能转换所必需的辅助因子组成.吸收光能后,放氧机构通过S_0→S_4循环转换氧化还原状态,将水分解形成分子氧.3个外周蛋白在光合氧释放过程中起着重要的作用.最近我们报道了一种新的释放PSⅡ放氧外周蛋白的方法:用不同浓度的三氯乙酸盐(TCA-NaOH)缓冲液处理PS Ⅱ膜颗粒,可以将3个外周蛋白逐一释放,这种处理同其它处理方法不同,不依赖于光照和介质pH,而且PSⅡ膜颗粒依然保持光化学活性,该方法使我们能够有特点地探讨放氧机构,如了解一个外周蛋白的逐次丢失给PSⅡ反应中心的结构带来什么样的改变以及对光能转换机制造成何种影响?本文中,我们利用Fourier变换红外光谱     

光系统Ⅱ反应中心的LB膜的形成及其圆二色性光谱的研究

由D1、D2及细胞色素b-559(cyt-559)3个多肽及其内部镶嵌的大约定4～6个che a,2个pheo a和1～2个β胡罗卜素组成的高等植物光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心属于膜蛋白,因其难于结晶,人们至今还无法利用X射线技术获得该蛋白的精确解.近年来,利用膜蛋白二维晶体通过电子显微镜与象重构技术获得三维结构信息的方法有很大的进展,而有序二维晶体的获得是关键的一步.本工作的目的是试图利用单分子膜技术形成保持与自然状态光谱性质类似的PSⅡ反应中心动的Langmuir-Blodgett(LB)膜,为进一步利用该技术形成二维晶体并研究其结构打下基础.并采用圆二色性对其构象进行了研究.1 材料和方法1.1 材料PSⅡ反应中心D1/D2/cyt-559复合物的分离纯化参照Nanba和Satoh的方法,从第一     

光系统Ⅱ反应中心电荷分离和能量传递的动力学研究

光合作用中最核心的步骤之一是在反应中心进行的原初反应,PSⅡ反应中心原初反应的机理研究已日益成为国际光合作用研究的焦点这一.1987年Nanba和Satoh首次分离纯化出PSⅡ反应中心D1/D2/Cyt b559复合物以来,国际上对PSⅡ反应中心的原初电荷分离(Charge separation)、电荷重组(Charge recombination)和能量传递过程的动力学性质采用时间分辨荧光光谱和吸收光谱及烧孔谱(Hole-burning Spectroscopy)等技术进行研究,已取得一些有意义的结果.但是,由于PSⅡ反应中心中色素分子的吸收光谱重叠严重,其吸收光谱在675nm处仅有一个吸收峰,无法选择性地激发原初电子供体P680,实验得到的数据比较复杂,不同实验室得到的动力学数据以及对实验数据的解释,都存在较大差异,甚至完全相反.本文以菠菜叶绿体中的PSⅡ颗粒、PSⅡ核心复合物(CP47/CP43/D1/D2/Cyt b559)和PSⅡ反应中心复合物(D1/D2/Cyt b559)为材料,用皮秒和飞秒激光技术对光系统Ⅱ反应中心电荷分离和能量传递的动力学进行研究,测定出光系统Ⅱ反应中心内部β-胡萝卜素和原初电子供体P680之间的能量传递以及PSⅡ反应中心原初电荷分离的时间常数,提出了可能的动力学模型.     

光系统Ⅱ反应中心的LB膜的形成及其圆二色性光谱的研究

<正>由D1、D2及细胞色素b-559(cyt-559)3个多肽及其内部镶嵌的大约定4～6个che a,2个pheo a和1～2个β胡罗卜素组成的高等植物光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心属于膜蛋白,因其难于结晶,人们至今还无法利用X射线技术获得该蛋白的精确解.近年来,利用膜蛋白二维晶体通过电子显微镜与象重构技术获得三维结构信息的方法有很大的进展,而有序二维晶体的获得是关键的一步.本工作的目的是试图利用单分子膜技术形成保持与自然状态光谱性质类似的PSⅡ反应中心动的Langmuir-Blodgett(LB)膜,为进一步利用该技术形成二维晶体并研究其结构打下基础.并采用圆二色性对其构象进行了研究.     

光系统Ⅱ反应中心D1/D2/cyt b559蛋白复合物的纳秒时间分辨光谱研究

光合作用是地球上最重要的化学反应.揭示光合作用的奥秘,对解决人类面临的能源、粮食、环境保护等问题十分重要.高等植物光系统Ⅱ可分解水,因此对其机理的研究就显得十分重要,而对光系统Ⅱ反应中心机理的研究,有助于人们深入理解光合作用的原初机理.为此,近些年来人们采用各种时间分辨光谱技术对光系统Ⅱ反应中心D1/D2/cyt b559蛋白复合物的电荷分离及复合过程进行了广泛细致的研究.但因此体系衰变组分较多,光谱重叠严重,所以对各成分的归属意见不一.为此,本文采用纳秒时间分辨光谱技术及光谱解叠方法对D1/D2/cyt b559的电荷复合过程进行了研究.     

光系统Ⅱ反应中心D1/D2/cyt b559蛋白复合物的纳秒时间分辨光谱研究

<正>光合作用是地球上最重要的化学反应.揭示光合作用的奥秘,对解决人类面临的能源、粮食、环境保护等问题十分重要.高等植物光系统Ⅱ可分解水,因此对其机理的研究就显得十分重要,而对光系统Ⅱ反应中心机理的研究,有助于人们深入理解光合作用的原初机理.为此,近些年来人们采用各种时间分辨光谱技术对光系统Ⅱ反应中心D1/D2/cyt b559蛋白复合物的电荷分离及复合过程进行了广泛细致的研究.但因此体系衰变组分较多,光谱重叠严重,所以对各成分的归属意见不一.为此,本文采用纳秒时间分辨光谱技术及光谱解叠方法对D1/D2/cyt b559的电荷复合过程进行了研究.     

衣藻细胞色素b559 α 亚基Ser24残基定点突变影响PSⅡ光合放氧活性

为研究细胞色素b₅₅₉ (Cyt b₅₅₉)在光合系统中的功能, 采用大引物定点突变技术, 将衣藻叶绿体Cyt b₅₅₉ α亚基(psbE基因编码)中与组氨酸(His²³)相邻的氨基酸残基丝氨酸(Ser²⁴)定点突变为苯丙氨酸(Phe), 获得突变体S24F. 对突变体的生理生化分析表明, S24F既能进行光合自养也能进行光合异养, 但是在自养和异养条件下, 其生长速率比对照慢; S24F的PSⅡ放氧活性约为野生衣藻细胞的71%, S24F的光系统Ⅱ(PSⅡ)光化学效率F_v/F_m比野生型对照低约0.23. 此外, 相比野生型对照, 突变体S24F对强光更加敏感; SDS-PAGE和Western杂交的结果表明, 对Cyt b₅₅₉ α亚基中Ser²⁴的定点突变影响了Cyt b₅₅₉ α亚基及其他膜蛋白, 如LHCⅡ和PsbO等的表达. 上述结果说明, 虽然Ser²⁴残基并不参与血红素配位, 但其对维持PSⅡ的活性具有重要作用.     

强光照处理菠菜叶片产生的交联聚合物中D1蛋白部分发生磷酸化

利用D1蛋白特异性抗体, 在强光照(800~2500 μmol photons·m^-2·s^-1)处理3 h的菠菜叶片类囊体膜中检测到4种D1蛋白聚合物, 它们的相对含量与处理时光照强度相关. 进一步分析表明, 70 kD聚合物为D1蛋白与CP43交联产物, 65和60 kD聚合物是D1蛋白与D2蛋白交联产物, 41 kD聚合物是D1蛋白与细胞色素b₅₅₉ α亚基交联物. 1000 μmol photons·m^-2·s^-1光照处理生成的D1/Cyt b₅₅₉聚合物最多, 光强增加时其含量下降. 磷酸化苏氨酸抗体Western blot分析结果显示, D1/Cyt b₅₅₉和D1/CP43聚合物中存在磷酸化蛋白; 外加磷酸酯酶处理后, 磷酸化的D1/Cyt b₅₅₉和D1/CP43聚合物减少. 上述结果表明, 强光照处理叶片引起D1蛋白与其他PSⅡ核心蛋白交联, 所生成的聚合物中部分D1蛋白以磷酸化形式存在.     

别藻蓝蛋白聚集体中的色素耦合模型

对别藻蓝蛋白 (APC)的亚基、单体、三聚体的电子吸收光谱及其色素耦合模型进行了详细研究 .APC单体的电子吸收光谱近似地为α亚基和 β亚基电子吸收光谱之线性叠加 ;而APC三聚体 (αβ) 3 的电子吸收光谱不再是两个亚基电子吸收光谱的线性叠加 ,在 6 5 0nm处出现了新的吸收峰 .现今的“二聚体模型”和“三聚体模型”都不能很好地解释该结果 .我们的模型仅忽略距离最远的不同单体的α_PCB的激子相互作用 ;并采用群论理论对其进行描述 ;分析结果不仅解释了APC三聚体在 6 5 0nm处新的吸收峰的出现 ,而且解释了在可见光区它至少有 3个本征跃迁 .     

系统Ⅱ反应中心复合物的磁圆二色性研究

近年来磁圆二色(MCD)光谱在分析金属卟啉及其与蛋白质的相互作用方面表现出独到之处,但MCD方法在光合作用研究中的应用很少见报道.现已得知,光系统Ⅱ反应中心(PSⅡ-RC)复合物中所含的几种色素都是金属卟啉类色素,本文报道了PSⅡ-RC的MCD谱,并对其中的部分谱峰组分进行了初步归属.PSⅡ-RC的MCD研究可以提供PSⅡ-RC的色素结构和与蛋白结合状态的新的信息,有助于解决因PSⅡ-RC吸收光谱在红区Q带吸收峰的严重重叠带来的困难.     

甲醇为探针研究活性光系统Ⅱ次级电子给体TyrZ与底物水分子作用机制

光系统Ⅱ（PSⅡ）次级电子给体TyrZ担负调控原初电荷分离和水的催化氧化功能. 目前有两类TyrZ调控机理模型被提出: 一类是TyrZ通过与底物水分子直接作用调控水氧化; 另一类是TyrZ处于疏水环境中, 不与底物水分子直接作用, 而是借助与His190之间氢键强度的变化调控水氧化. 本文利用低温电子顺磁共振技术研究与水分子类似的甲醇分子对活性PSⅡ中TyrZ氧化还原特性的影响, 发现当Mn簇处于S2和S0态时, 甲醇分子的存在能够明显促进TyrZ的低温氧化和TyrZ•的低温还原. 理论计算显示: (1)当甲醇分子与Tyr直接作用时会导致Tyr氧化变难; (2)伴随环境极性降低, Tyr的氧化变得容易. 综合这些结果, 我们推测在活性PSⅡ中甲醇分子不与TyrZ直接作用, 甲醇对TyrZ的低温氧化及TyrZ•的低温还原的促进作用可能是由于甲醇分子替换PSⅡ内部的水分子, 降低了TyrZ-His190周围环境的极性, 使TyrZ与His190之间的氢键强度增加所致. 鉴于甲醇分子与水的类似性, 以上结果支持我们最近提出的活性PSⅡ中TyrZ不与水分子直接作用的观点.     

三氯乙酸盐对莱因衣藻类囊体EPR信号SignalⅡslow和SignalⅠ的影响

植物光系统Ⅱ反应中心Ｄ２多肽第１６０位酪氨酸残基（Ｙ_Ｄ）氧化可以产生电子顺磁共振（ＥＰＲ）信号 Ｓｉｇｎａｌ Ⅱ_（ｓｌｏｗ．）高浓度的三氯乙酸盐（ＴＣＡ）短时间处理莱因衣藻（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）类囊体可以直接促使氧化态的 Ｙ_Ｄ（Ｙ_Ｄ）迅速还原,淬灭 Ｓｉｇｎａｌ Ⅱ_（ｓｌｏｗ·）这种作用具有浓度和时间效应．ＴＣＡ处理引起类囊体膜上包括３个放氧外周多肽在内的部分多肽脱落．在衣藻光系统Ⅱ反应中心三维分子模型的基础上对Ｙ_Ｄ周围的氨基酸微环境进行了分析,认为Ｙ_Ｄ周围相对较强的疏水性微环境可能是 ＴＣＡ影响 Ｙ_Ｄ氧化还原状态的前提．同时, ＴＣＡ处理还能稳定源于光系统 Ⅰ中氧化态的反应中心色素双分子 Ｐ_（７００）~＋的 ＥＰＲ信号 Ｓｉｇｎａｌ　Ⅰ,抑制其衰减．     

别藻蓝蛋白聚集体中的色素耦合模型

对别藻蓝蛋白 (APC)的亚基、单体、三聚体的电子吸收光谱及其色素耦合模型进行了详细研究 .APC单体的电子吸收光谱近似地为α亚基和 β亚基电子吸收光谱之线性叠加 ;而APC三聚体 (αβ)₃ 的电子吸收光谱不再是两个亚基电子吸收光谱的线性叠加 ,在 6 5 0nm处出现了新的吸收峰 .现今的“二聚体模型”和“三聚体模型”都不能很好地解释该结果 .我们的模型仅忽略距离最远的不同单体的α_PCB的激子相互作用 ;并采用群论理论对其进行描述 ;分析结果不仅解释了APC三聚体在 6 5 0nm处新的吸收峰的出现 ,而且解释了在可见光区它至少有 3个本征跃迁.     

水稻Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因OsWIP1-2的诱导表达及其抑制活性

克隆了水稻的WIP1基因, 该基因属于Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI)家族. RNA杂交实验结果显示该基因的表达受伤害和茉莉酮酸的诱导, 表明它在植物防御反应中起着重要的作用. 将此基因克隆到表达载体pET28a, 并在大肠杆菌中表达融合蛋白. 分别用胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶为底物检测纯化的融合蛋白的抑制活性, 发现融合蛋白具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 但没有对胰蛋白酶的抑制活性; 同时发现融合蛋白C端的融合残基对蛋白酶抑制活性有重大影响, 具有C端(His)₆纯化标签的融合蛋白不具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 而有天然C端序列的融合蛋白具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 这暗示了过长的C末端序列可能会影响WIP1蛋白的正确折叠. 蛋白酶抑制活性分析表明水稻Bowman-Birk抑制剂家族的成员可能在结构和功能上均发生了分化.     

Cl~-维持PSII锰复合物功能结构的实验证据

锰原子附着在植物光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心D_1和D_2蛋白上,构成锰蛋白复合物,在外周天线蛋白(47,43kD)、3种水溶性蛋白(33,23,17ku)、无机离子Ca~(2+)和Cl~-的辅助调节下,吸收光能,通过S_0→S_4态的循环,将水分解,形成分子氧.用氯化钠溶液清洗去除23,17ku水溶性蛋白后,水分解酶中锰原子极易被PD(Phenylenediamine,苯二胺)和HQ(Hydroquinone,氢醌)之类还原剂攻击,由Mn≥3+还原形成Mn~(2+)并释放出水分解酶,此过程伴随着水分解活性的相应降低.     

高等植物光系统Ⅰ-捕光天线Ⅰ(PSⅠ-LHCⅠ)超分子复合物的晶体结构和能量传递途径

光合作用光能的吸收、传递和转化是由位于光合膜上具有特定的分子排列和空间构象的色素蛋白复合物光系统Ⅱ(PSⅡ)和光系统Ⅰ(PSⅠ)所推动的.其中PSⅠ是一个具有极高效率的太阳能转化系统,其量子转化效率几乎为100%,但其高效吸能、传能和转能的结构基础尚不清楚.从高等植物碗豆的叶片提取了高纯度的光系统Ⅰ-捕光天线Ⅰ(PSⅠ-LHCⅠ)色素蛋白超分子复合物,并制备和解析了其2.8?的晶体结构[1].PSⅠ-LHCⅠ超分子复合物由16个蛋白亚基组成,总分子量约600 k D.本结构全面解析了高等植物PSⅠ-LHCⅠ的精细结构,揭示了PSⅠ-LHCⅠ的4个不同的捕光天线(Lhca1,Lhca2,Lhca3,Lhca4)在与PSⅠ核心复合物结合状态下的结构和它们的异同,以及它们之间的相互关系;揭示了LHCⅠ全新的色素网络系统,辨别了叶绿素a和b的不同位置,并阐明了4对红叶绿素(red Chls)和13个类胡萝卜素的结合位点和结构.根据所解析的结构,提出了由LHCⅠ向PSⅠ核心复合物能量传递的4条重要的可能途径.这些结果为揭示高等植物PSⅠ高效吸能、传能和转能的机理奠定了坚实的结构基础.本文将介绍所解析的高等植物PSⅠ-LHCⅠ的精细结构,并讨论PSⅠ-LHCⅠ能量传递机制.     

神经红蛋白的表达、分离纯化和谱学表征

报道了神经红蛋白(NGB)的基因表达、分离纯化和谱学表征. 将载有NGB基因的pET3a质粒转入E.Coli BL21(DE3)plys细菌, 于TB培养基中进行表达, 其表达量占菌体总蛋白的10%左右. 依次经硫酸铵分级沉淀, DEAE-Sepharose阴离子交换柱, Hiload16/60 Superdex 75凝胶过滤柱和Hiprep 16/10 Q FF 阴离子交换柱纯化, 得到了电泳纯的血红色可溶性蛋白. 电喷雾质谱测得其分子量为16930.0 Da. 紫外-可见吸收光谱表明, 还原态的NGB在425 nm有一强吸收峰, 在531和559 nm处有弱吸收峰, 它们可分别归属为金属卟啉的γ,β和α吸收带, 氧化态的NGB在413 nm处有强吸收, 则对应于金属卟啉的γ吸收带, 是电子在卟啉环中非定域化π电子的轨道跃迁(π→π*)的结果. 荧光激发谱最大波长为281 nm, 发射谱最大波长为338 nm. 圆二色谱表明其二级结构为典型的a螺旋结构, 在410 nm处有一血红素正峰. 酸稳定性研究表明, pH>4时蛋白稳定.     

甜菜碱对PSⅡ放氧中心结构的选择性保护

植物光系统Ⅱ( PS Ⅱ)放氧中心复合体主要包括跨类囊体膜的D1,D2多肽和暴露于水相的分子量分别为18,23,33ku的3个外周蛋白.高浓度盐等多种处理方法,都可使外周蛋白部分或全部脱落,进而影响水氧化放氧的关键机构——锰分子簇的正常运转.最近报道的三氯乙酸盐处理放氧中心复合体是一种使与放氧有关的外周蛋白依次脱落的新方法,其作用特点与分子的疏水性有明显的相关性.由于外周蛋白暴露于水相之中,容易遭受水分胁迫的影响,因而PSⅡ膜颗粒可成为植物水分胁迫研究的一个理想模型. 甜菜碱是一种较普遍存在于细菌及动植物中的渗透调节物质,在高盐条件下的组织中尤为常见.90年代以来,一些实验证明,甜菜碱可以保护PSⅡ颗粒,防止高浓度盐造成的外周蛋白脱落;研究还表明,甜菜碱可以稳定Mn簇的空间结构,维持在高盐环境中 PSⅡ颗粒的放氧活性.而高浓度甜菜碱本身不影响PSⅡ颗粒的放氧功能.本实验通过用NaCl、三氯乙酸钠(TCA)处理PSⅡ膜颗粒,比较两种处理时,甜菜碱稳定外周蛋白的作用有何异同,进一步研究甜菜碱稳定作用的本质.     

EB病毒潜伏膜蛋白1介导c-Jun/Jun B异源二聚体对p16的调节

EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1 (LMP1)是重要的致瘤蛋白, 可活化包括AP-1在内的多个转录因子. 转录因子功能性活化体现在其与靶基因启动子结合, 反式激活靶基因转录, 调节靶基因的表达, 从而发挥其生物学效应. 最近发现LMP1可介导c-Jun/Jun B活性异源二聚体的形成, 为寻找其靶基因提供了重要的依据. 采用生物信息学技术, 确定了c-Jun/Jun B活性异源二聚体调控的潜在靶基因p16; 在此基础上, 利用建立的Tet-on系统调控LMP1表达的细胞系, 采用间接免疫荧光法联合激光共聚焦荧光显微镜技术、Western blot方法、荧光素酶活性检测、Super-EMSA方法和流式细胞术, 探讨LMP1介导c-Jun/Jun B异源二聚体对p16的调节功能. 结果表明, LMP1介导的c-Jun/Jun B异源二聚体可下调p16启动子活性及其表达, 并影响细胞的演进. 该研究在AP-1信号传导通路和细胞周期之间建立了新的直接联系, 从而为肿瘤发病机制研究提供了新的思路和实验模式.