猪黑皮质素受体3和4基因克隆及分析

以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆长白猪黑皮质素受体3和4基因(MC3R和MC4R).序列分析显示:长白猪MC3R基因cDNA编码具319个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠和斑马鱼的氨基酸序列一致性分别为86.4%、83.3%、82%和69.7%;MC4R基因cDNA全长1175bp,编码具332个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠的氨基酸序列一致性高达94%以上,与斑马鱼MC4R氨基酸序列享有70.7%的同源性.序列分析显示,猪MC3R和MC4R基因都具有典型的七次跨膜结构域,和短的胞内环和胞外环,且在第五个跨膜域中保守的甲硫氨酸(M)分别替换为异亮氨酸(I)和缬氨酸(V).另外,在猪MC3R和MC4R中还鉴定到保守的半胱氨酸残基,第一个胞内环中保守的PMY基序和N末端的3个N-链接糖基化位点.组织表达图谱分析表明,MC3R主要在大脑和脾中高表达,而MC4R主要在六种检测的组织中都有表达,在肾中表达较弱.     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的分离

以黑曲霉基因组DNA、mRNA为模板,利用种属相似性设计了一对引物,采用PCR与RT-PCR技术得到β-葡萄糖苷酶基因的DNA和cDNA全序列.测序表明:克隆得到的DNA序列全长2 924 bp,cDNA序列全长2 583 bp,编码860个氨基酸.编码序列推导的蛋白质序列相似性分析显示:完整蛋白质序列同源性高达97%～99%.该研究为β-葡萄糖苷酶基因的遗传转化及应用 奠定了基础.     

牛结核分枝杆菌PstS3基因克隆与序列分析

以牛结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis）基因组DNA为模板,克隆PstS3基因,并进行序列测定,然后利用生物信息学软件对其序列进行分析.结果显示,PstS3基因全长1 113 bp,编码370个氨基酸,与GenBank所发表的人结核分枝杆菌PstS3基因的核苷酸同源性为99.82%,氨基酸同源性为99.4%,有1处位点发生有义突变.     

毛竹硅转运基因PhLsi1的ORF克隆及生物信息学分析

以水稻硅的内转运蛋白基因Lsi1的cDNA序列为信息探针,对毛竹的核酸数据库进行同源性搜索,获得全长为797bp的毛竹硅内转运蛋白基因的cDNA序列(Genbank登陆号:FP095571).与水稻Lsi1的cDNA序列相比,毛竹中该基因cDNA序列第721位处发生终止突变,导致毛竹Lsi1丢失了86个氨基酸残基.采用RTPCR方法对其进行克隆,序列分析表明,PhLsi1基因在编码时确实存在提前终止现象,共编码212个氨基酸,与水稻、玉米和大麦中已克隆的硅内转运蛋白(silicon influx transporter,含有6个跨膜螺旋区和2个NIP保守基序)的序列相似性分别高达99.3%,91.9%,91.9%,但只具有5个跨膜螺旋区和1个NIP保守基序.     

牦牛和黄牛睾丸组织Prdm9基因cDNA序列的比较

为比较牦牛与普通牛Prdm9基因的序列特征,采用RT-PCR和3’-RACE方法,从牦牛和黄牛睾丸组织总RNA中分别获得Prdm9基因的部分cDNA序列,经过拼接后获得了牦牛和黄牛Prdm9基因的完整cDNA序列,长度分别为2580bp和2421bp,编码序列长度均为2091bp,共编码696个氨基酸,氨基酸序列相似性为98.56%.分析显示,牦牛和黄牛Prdm9基因开放阅读框有10个核苷酸同义突变和10个单核苷酸多态性(SNPs),并导致10个氨基酸差异,其中4个位于锌指域.研究结果表明,牦牛和黄牛Prdm9基因结构特征类似,但在锌指域存在一些氨基酸差异,可能会影响该基因的功能.     

牦牛INHBA基因的克隆及序列分析

根据GenBank检索到的普通牛的INHBA基因序列设计一对特异性引物,以牦牛卵巢组织总RNA为模板,通过RT-PCR技术对牦牛INHBA cDNA进行克隆测序和序列分析.结果表明:扩增片段1360bp,包含1277bp的编码区,编码426个氨基酸.与普通牛相比,牦牛INHBA基因编码区存在2处碱基转化.牦牛与普通牛、绵羊、人、鼠和猪的核苷酸序列同源性分别为99.84%、97.97%、91.41%、87.79%、91.94%,氨基酸序列同源性分别为99.53%、98.82%、95.77%、93.88%、93.88%.蛋白质结构分析显示,INHBA蛋白不易形成α螺旋和跨膜结构,是相对保守的疏水性蛋白.     

猪STAT4、STAT6基因克隆及组织表达研究

本研究以长白猪为材料,克隆了STAT4和STAT6基因的cDNA全长,其中STAT4基因cDNA全长2269 bp,编码748个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠等哺乳动物STAT4氨基酸序列一致性分别为97%、98%、96%、96%;STAT6基因cDNA全长2637 bp,编码847个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、大鼠、小鼠等哺乳动物的氨基酸序列有很高的同源性,分别为93%、95%、88%和87%.采用RT-PCR方法,本研究对家猪STAT4和STAT6基因进行组织表达分析.结果显示:STAT4在所有组织中都有表达,STAT6在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、小肠等组织中有表达.此外,本研究已将家猪STAT4和STAT6基因编码区序列克隆到真核表达栽体pcDNA3.1(+)中,并做了初步功能鉴定.     

鳜鱼(S.Keneri)肌球蛋白重链基因cDNA的克隆及其特征分析

鳜鱼(S.Keneri)以优良肉质性状成为极具商品价值和大力推广人工养殖名贵鱼类之一.为掌握控制优良肉质性状的遗传基础,采用同源克隆RT-PCR方法,克隆出该鱼肌球蛋白重链(MYH)cDNA序列.该基因cDNA序列全长5938bp,编码区长度为5814bp,含有poly(A)信号,3’非翻译区长124bp,其开放阅读框共编码1938个氨基酸,推算蛋白质分子质量为221.6Ku.鳜MYH基因由3个结构域组成,即MYSc-type-Ⅱ,SMC-N和Myosintail 1,其中MYSc-type-Ⅱ头部结构与鲤、斑马鱼同源性达90%,具高度保守性.通过DNAstar软件MegAlign构建进化树显示不同物种间该基因核苷酸编码序列同源性为77%—86%,氨基酸编码序列同源性达80%—92%.采用RT-PCR方法研究MYH在不同发育阶段差异表达结果表明,MYH在肌肉效应期开始有低量表达,成鱼期和鱼苗期表达量高,而囊胚期与神经胚均未表达.由此推测MYH基因于肌肉效应期开始表达.研究结果揭示鳜鱼肌球蛋白重链基因在进化上保持与其他脊椎动物相似性和差异性,为决定名贵鱼类肉质结构基因的研究提供了分子生物学基础.     

Armillariella tabescens阿拉伯糖苷酶基因全长cDNA的克隆与表达

通过对假密环菌(Arm illariella tabescens)的表达cDNA克隆文库进行随机测序,获得一段与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列同源性很高的EST序列(AJ620046).根据获得的EST序列用SMART-RACE技术成功从假密环菌中克隆出了阿拉伯糖苷酶基因的全长cDNA,用生物信息学的方法对所获的序列进行信息学分析.分析结果显示其全长cDNA为1 016 bp,其最长的开放阅读框架为924 bp,编码307个氨基酸,该全长cDNA序列与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列具有较高同源性,80~279位氨基酸序列属于阿拉伯糖苷酶超家族,58~184位氨基酸是一个典型的结构功能域,蛋白分子质量预测为32 881 u,等电点为4.59.构建重组质粒pPIC9-AF,并在毕赤酵母菌GS115中对所获得的基因进行了表达,相对酶活达到了81.25%.     

长爪沙鼠Eef1a2基因的克隆与同源性分析

目的长爪沙鼠真核蛋白延长因子1a2(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,Eef1a2)基因的克隆,测序和同源性分析。方法提取长爪沙鼠骨骼肌组织的mRNA,通过同源扩增和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆Eef1a2 cDNA序列全长。通过DANSTAR软件比对长爪沙鼠和人类、大鼠、小鼠Eef1a2的cDNA和氨基酸序列,并分析其同源性。结果长爪沙鼠Eef1a2 cDNA序列全长1812 bp,编码区(coding sequence,CDs)1392 bp,编码463个氨基酸。其核苷酸序列与人类、大鼠和小鼠的同源性分别为88.6%,94.0%和93.8%;长爪沙鼠Eef1a2氨基酸序列与人类、大鼠和小鼠的同源性分别为100%,99.9%和99.9%。结论长爪沙鼠Eef1a2的核苷酸序列和氨基酸序列均与人、大鼠、小鼠高度同源。因此,长爪沙鼠可能是一种人类Eef1a2基因研究的理想模型。     

牦牛肥胖基因和肿瘤坏死因子α基因的序列分析

肥胖基因(ob gene)是近年来刚被克隆的新基因，该基因的表达产物瘦蛋白(Leptin)具有调节体重、影响动物生长和繁殖率等一系列生物学功能．肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)是一种主要由活化单核巨噬细胞和T淋巴细胞产生的多效性细胞因子，时TNF-α基因的基础及应用研究已成为近年来动物抗病育种的研究热点之一，本文克隆及测序分析了牦牛上述两个基因的部分片段。结果表明：ob基因大小为1773bp，TNF-α基因为1160bp，通过genebank中的blastn比较分析牦牛ob基因和TNF—α基因与普通牛种的相应基因同源性都高达98％。     

牦牛SRY和TRO基因部分序列克隆与测序分析

对牦牛SRY和TRO的部分基因克隆和序列分析,以期为牦牛X精子和Y精子鉴定、性染色体的基因定位以及分子标记辅助选择研究提供理论依据.从牦牛和西门塔尔牛冷冻精液中提取DNA,用特定引物对SRY、TRO基因部分序列进行扩增并进行TA克隆和测序.结果表明,这两个基因区域在牛种中有极高的保守性,牦牛与普通牛SRY和TRO基因这两个区域的核酸同源性分别高达99.08%和99.39%.     

牦牛和犏牛睾丸SAMD12基因的克隆测序及其mRNA水平比较

SAMD12是新近发现的SAM结构域家族成员.为进一步探究犏牛雄性不育的分子机制,实验从健康成年牦牛(n=10)和雄性不育犏牛(n=7)睾丸组织中提取总RNA,利用常规基因克隆技术,对牦牛SAMD12基因进行克隆测序,并采用实时荧光定量PCR技术,比较牦牛和犏牛睾丸中SAMD12基因mRNA水平.结果本实验克隆获得了牦牛SAMD12基因的3种变异体,分别命名为v715、v779和v852.v715与普通牛5号变异体完全对应;v779含SAM结构域但与普通牛序列存在一些差异,可能是SAMD12基因的新变异体类型;v852无结构域部分可能不表现活性.定量PCR结果显示:SAMD12基因在牦牛和犏牛睾丸中均有表达,但表达量差异不显著,推测其表达水平与犏牛雄性不育无直接关系.     

莴苣黄化病植原体的分子鉴定

为了明确新疆莴苣黄花病植原体的分类地位,采用巢式PCR和PCR技术对表现黄化症状的莴苣植株分别利用植原体16S rRNA基因和tuf基因通用引物P1／P7、R16F2n／R16R2和fTufu／rTufu进行扩增,得到大小约1．2kb和0．8kb的特异性片段,对所得片段克隆、测序和序列分析。结果表明：它们分别和榆树黄化组（Elm yellows group）成员的16S rRNA基因、tuf基因同源性最高,分别高于98．6％和92．4％。基于16S rRNA基因和tuf基因的系统进化树分析显示,其均与植原体16Sr V组成员位于同一分支上。对16S rRNA基因的iPhyClassifier分析结果表明,其与榆树黄化组B亚组（16Sr V—B）代表株系JWB（AY197661）具有相同的酶切图谱。所有结果表明莴苣黄化病植原体（LSY）属于榆树黄化组B亚组（16Sr V-B）。     

拉布拉多犬与金毛猎犬毛色基因MC1R(R306ter)与TYRP1(Q331ter)SNP位点的检测

目的建立犬毛色基因MC1R R306ter(c.C916T)与TYRP1 Q331ter(c.C991T)SNP位点的检测方法。方法采用PCR/测序的方法,对19只拉布拉多犬和15只金毛猎犬的MC1R基因c.C916T SNP位点及TYRP1基因c.C991T SNP位点的多态性进行检测,根据MC1R和TYRP1的多态性对犬的毛色基因型进行分析。结果 PCR/测序法能够对TYRP1基因c.C991T SNP位点进行明确和有效的检测。但MC1R基因c.C916T SNP位点的测序结果出现了特殊峰,经克隆/测序法确认该特殊峰型为杂合性SNP位点。毛色基因型分析表明,金毛猎犬的毛色基因型皆为纯合的eeBB(15只),未见其他基因型。拉布拉多犬的毛色基因型分别为:黑色犬EeBB(6只)、EeBb(2只);黄色犬eeBB(9只)、eeBb(2只)。未发现其他如EEBB和EEBb(黑色)、eebb(黄色)的毛色基因型。另外,拉布拉多犬样本中没有巧克力色犬,也未检测出其相应的Eebb和EEbb基因型。结论本研究成功建立了犬毛色基因MC1R R306ter(c.C916T)与TYRP1 Q331ter(c.C991T)SNP位点的检测方法,为分析毛色基因型与导盲犬培训成功率之间的相关性提供了前期工作基础。     

南方菟丝子18S rRNA基因片段的克隆与序列分析

根据拟南芥光敏色素B基因序列设计引物, RT-PCR扩增南方菟丝子同一基因相应片段, 扩增使用了TD PCR技术,同时获得3个特异基因片段,对长约300 bp的片段克隆后进行序列分析,显示该片段与沼泽菟丝子和拟南芥18S rRNA基因相应片段的一致性分别为98.9%和97%,结果表明,该片段为南方菟丝子18S rRNA基因片段.     

产毒素大肠杆菌LTB-K99融合基因的构建

利用PCR技术从原始菌种中扩增得到K99和LTB基因,将K99和LTB基因连接起来,构建了LTB-K99融合基因.融合基因克隆到pBS-T载体上,转化大肠杆菌top10,经Bam HI和Xho I双酶切鉴定重组质粒.测序分析结果表明,该融合基因有正确的阅读框,为以后转入表达载体的构建奠定了基础.     

基于mtDNA CO I基因的西藏牦牛遗传多样性及系统进化研究

为从分子水平上探讨西藏牦牛的序列多态性、群体遗传多样性和系统进化关系,本研究对17个西藏牦牛类群170个个体的mtDNA COⅠ全序列进行测序,用MEGA5.0、DNASP5.0等软件分析核苷酸组成、单倍型多样性和核苷酸多样性.基于Kimura-2-Parameter双参数模型,分别采用邻近法（NJ）和最大似然法（UPGMA）构建系统进化树,分析不同牦牛类群的亲缘关系和分类.结果表明：①西藏17个牦牛类群的mtDNA COⅠ全序列长度均为1 545 bp,个体间无长度差异,无内含子,起始密码子为AUG（ATG）,终止密码子为UAA（TAA）,共编码514个氨基酸.T、C、A和G4种碱基的平均含量分别为29.5％（29.3％ ～ 29.8％）、25.5％（25.2％ ～ 25.6％）、28.7％（28.6％ ～ 28.9％）和16.3％（16.2％ ～ 16.5％）; A＋T的平均含量为58.2％,存在一定的碱基偏倚性.②在17个西藏牦牛类群的170头牦牛中,共发现mtDNA COⅠ有25种单倍型,单倍型多样性值在0～0.978之间,平均单倍型多样性和核苷酸多样性值分别为0.566、0.00326,表明西藏牦牛具有较丰富的遗传多样性.③西藏牦牛mtDNA CO Ⅰ中亮氨酸平均含量最多（11.496％）,半胱氨酸平均含量最少（0.1946％）.碱性氨基酸、酸性氨基酸的含量分别为6.6171％、4.8627％;亲水性氨基酸、疏水性氨基酸分别为57.39％、42.61％.④基于mtDNA COⅠ,西藏17个牦牛类群可分为2大类,即类乌齐（LWQ）牦牛单独成一类,其它牦牛类群聚为一类.     

Genetic polymorphisms of milk epithelial mucin of yaks

Milk epithelial mucin (MUC1) of yaks was separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. A total of nine types of MUC1 were revealed in 427 yaks from five yak breeds including Maiwa yak, Jiulong yak, Tianzhu white yak, Qinghai yak and Tibetan yak. The molecular weights of MUC1 are from 163 kD to 208 kD, most of which are larger than those of bovine. Population genetic analysis shows that the gene frequency and genotype frequency of yak MUC1 differ among breeds, with relatively high gene heterozygosity. The five yak breeds studied fall into two groups according to their milk MUC1 gene frequency, suggesting that milk MUC1 exhibits specificities for local yak groups.