奇蹄目核糖核酸酶基因超家族(RNASE A)的分子进化研究

为深入认识核糖核酸酶基因超家族(RNASE A),以奇蹄目的家马、驴、野马和白犀牛为研究对象,分析RNASE A序列、鉴定真假基因、预测等电点及构建系统发育树.结果揭示每个物种的RNASE A序列数并不相同,RNase4在该研究物种分歧之前发生1次基因复制,其中1个拷贝保留功能,另外1个拷贝发生假基因化并在不同物种中有不同程度的保留或丢失,而RNase2/3和RNase7/8经历"基因分拣"进化模式.另外,典型的RNASE A序列特征在RNase9—13中发生变异,揭示RNase9—13可能丢失核糖核酸酶活性而具有其他新功能.总之,该研究系统探讨了奇蹄目RNASE A的分子进化,增加了该基因超家族研究的多样性,为更加深入开展RNASE A研究提供了基础.     

啮齿目中RNase4基因的分子进化研究

RNase4基因是RNASE A基因超家族中的一个重要成员,是分子进化研究的最佳模型之一.首次在基因组水平对啮齿目中的16个物种进行RNase4基因深入分析.在白臀豚鼠、几内亚猪、鹿白足鼠和非洲跳鼠中检测到不同程度的RNase4基因扩张,并且经历了3次独立的基因复制事件.其中,在白臀豚鼠和几内亚猪中检测到1次基因复制事件;在鹿白足鼠和非洲跳鼠中发生2次基因复制事件,并且经历了"生与灭"的进化模式.     

核糖核酸酶Ⅲ超家族与RNA干扰

核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)是一个在生物体中普遍存在的酶类,它具有把RNA前体加工成有功能的RNA、参与RNA干扰和其它细胞活性的功能.RNaseⅢ超家族包括大肠杆菌的核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)、酵母核糖核酸酶t1(Rnt1)、植物中的核糖核酸酶Dicer和哺乳动物中的核糖核酸酶Drosha,它们都具有在特定位点或者特定的序列区域识别和切割双链核糖核酸(dsRNA)的能力.对RNaseⅢ超家族的种类、结构和功能、作用机制及其在RNA干扰中所起的重要作用以及在生命科学研究中的应用进行了归纳总结.     

野桑蚕漆酶基因克隆、序列分析及转录表达谱研究

利用RT-PCR方法,克隆了野桑蚕Bombyx mandarina漆酶基因,获得了其cDNA序列.该序列长2 317bp,含有一个2 295bp的完整开放阅读框,有8个外显子,7个内含子,编码一个由764个氨基酸残基组成的蛋白质,其蛋白质的分子量和等电点分别为84 340.91和6.61.推导的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫(Laccase)基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的漆酶基因所共有的典型特征.组织特异性表达分析表明了该基因仅在野桑蚕的表皮、头部、中肠和血液中有表达.这些结果为进一步研究野桑蚕漆酶基因的功能提供了分子基础.     

牛胰核糖核酸酶结晶的制备

牛胰核糖核酸酶(E.C 2.7.7.16)首先由Kunitz用硫酸铵分级盐析的方法获得结晶,然而在多次重结晶后仍含有微量蛋白水解酶的活性。McDonald利用加热的方法除去这些掺杂的蛋白质后,得到了无蛋白水解酶活力的纯牛胰核糖核酸酶结晶。随后,Hirs等将结晶RNase在IRC-50(XE-64)的树脂上层析分离,分出A及B二个组分,比例为10:1。Taborsky将结晶RNase在CM-纤维素上层析,得到一个主峰和三个小峰,都具有酶活力,主峰相当于RNase A。     

串珠藻目植物psaA基因的适应性进化及共进化分析

串珠藻目是淡水红藻中最重要的类群。psaA基因是植物叶绿体中进行光调节的重要基因,编码光系统Ⅰ反应中心跨膜复合物的中心蛋白A,又称P700脱辅基蛋白A,承担重要的生物学功能,构成植物光系统Ⅰ的中心架构。为了探究串珠藻目植物适应特殊生存环境的分子水平机制,选取串珠藻目及一些相近类群淡水红藻的psaA基因42条,并采用PAML4.8软件中的位点模型、分支模型和分支-位点模型,对选取类群的psaA基因进行了适应性进化分析。结果表明:(1)所有内类群聚集为9个分支,其中,分支A为假枝藻属,分支B为Nocturama属,分支C为西斯藻属,分支D为连珠藻,分支E为胶串珠藻,分支F为熊野藻属,分支G为串珠藻属,分支H为暗紫红毛菜,分支I为红索藻属;(2)没有在位点模型和分支-位点模型中检测到有统计学意义的正选择位点,提示该基因处于强烈的负选择作用之下并具有保守性;(3)基于详细的解析数据和氨基酸对的相关系数统计出共进化组(对)5组(20对),序列中所有共进化氨基酸对的平均距离27.808 6?,标准差12.325 2,基于氨基酸疏水相关性值统计出的共进化组(对)5组(12对),基于氨基酸分子量相关值统计出的共进化组(对)5组(15对),其中共有11对共进化氨基酸同疏水性、分子量都显著相关。本研究结果显示psaA基因在串珠藻目植物中是非常保守的,比较适用于属及以上分类单元群体的系统发育关系研究,同时,基于ω比值检验基因适应性进化具有准确性和有效性。     

基于EF1-a基因对常见禾本科作物的聚类分析

基于EF1-a基因核苷酸序列和氨基酸序列,利用分子进化遗传分析软件MEGA 5.0构建常见禾本科植物的最小进化法（ME）、邻接法（NJ）和算术平均数的非加权成组配对法（UPGMA）分子系统进化树.研究结果表明,EF1-a cDNA序列和氨基酸序列的聚类分析都能够反映所列禾本科植物的属间关系,3种进化树的聚类分析分支情况基本一致.基于EF1-a基因的cDNA序列和氨基酸序列构建的ME、NJ树适合用来研究禾本科作物种间或种内的遗传关系,而构建的氨基酸序列UPGMA树有待更多的数据研究.     

miR-430基因簇的生物信息学分析

很多microRNA （miRNA）基因在基因组上紧密排列形成miRNA基因簇,mir-430是目前已发现的最大miR-NA基因簇,但其起源和进化方面却是未知的.为了揭示mir-430基因簇的起源及其在相关物种的进化关系,文中基于miRNA序列同源保守的特点,采用BLAST程序在NCBI基因数据库中搜索mir-430序列,在14个物种中共搜索到35个mir-430基因序列,这14个物种都为硬骨鱼类.多序列对比发现mir-430基因簇成熟序列的第2到第8位碱基以及第16到第22位碱基为保守序列.进化分析表明七鳃鳗的pma-mir-430基因可能是此基因家族最早出现的基因形式,并且pma-mir-430e可能是其他物种mir-430基因的祖先基因.祖先基因经过个别碱基的缺失及突变、串联重复和大片段重复等方式形成了mir-430基因簇.该研究通过分析不同物种中mir-430基因簇的特征,揭示mir-430基因簇的分子进化规律,为其调控网络和功能研究提供理论基础.     

无蹼壁虎6个鸟类Z染色体连锁基因的cDNA克隆和序列分析

利用RT-PCR技术从无蹼壁虎中获得了6个鸟类Z染色体连锁基因的cDNA片段序列.与铅山壁虎的同源基因序列相比,除CHD1-5'端序列中有3 bp的缺失外,其他基因序列均具有相同的核苷酸和氨基酸长度,且核苷酸序列和氨基酸序列的保守性均非常高(97%~100%).在与有鳞目、龟鳖目和鳄目的其他已知序列比较时,发现6个基因的8个片段有不同程度的同源性,其中GHR基因的同源性最低,与该基因片段在进化分析中较高的ω值(Ka/Ks)是一致的.性染色体连锁基因的克隆和染色体定位,将有助于进一步了解壁虎类甚至高等脊椎动物不同类型性染色体的起源和进化.     

斜带石斑鱼肝脂酶和脂蛋白脂酶基因克隆与序列分析

为从分子水平研究海水鱼类肝脂酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白脂酶(liportein lipase,LPL)基因在脂质代谢过程中的作用及其分子系统进化地位,采用RT-PCR及RACE法从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏克隆得到HL、LPL基因cDNA全序列.克隆获得斜带石斑鱼肝脏HL基因cDNA全长2 261 bp,其中5′非翻译区(5′-UTR)为186 bp,3′-UTR为590 bp,开放阅读框(ORF)为1 485 bp,编码494个氨基酸;LPL基因cDNA全长2 191 bp,其中5′-UTR为 144 bp,3′-UTR为 499 bp,ORF为1 548 bp,编码515个氨基酸.序列同源性分析表明,斜带石斑鱼HL、LPL基因与哺乳动物同源性均低于真骨鱼类罗非鱼、斑鳢和真鲷等,这与其亲缘远近关系相一致,表明HL、LPL在进化过程中都相对保守.构建系统发生树显示,斜带石斑鱼HL、LPL基因氨基酸序列与大口黑鲈、真鲷等共同占据进化树上独立的分枝,与较为原始的硬骨鱼类中华鲟在进化树上距离较远.本实验对斜带石斑鱼HL、LPL基因同源性、系统进化地位的研究,为进一步研究海水鱼类脂代谢调控机制,预防鱼类脂代谢疾病奠定了基础.     

棉纤维细胞色素单加氧酶基因GhCYP714A1促进活性氧的累积

本研究利用RT-PCR技术从陆地棉纤维组织中克隆得到了1个棉花细胞色素P450基因(Cytochrome P450714A1)的全长c DNA序列,将该基因命名为GhCYP714A1。序列分析发现,该cDNA包含1563 bp的完整开放读码框,编码521个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为57.31 kDa;氨基酸序列生物信息学分析显示,Gh CYP714A1蛋白具有跨膜结构域和多个蛋白结合位点;进化树分析结果表明,棉花Gh CYP714A1与禾草SiCYP714B1在进化上亲缘关系上较近;半定量RT-PCR的组织表达特异性分析表明GhCYP714A1基因与纤维突起形成发育有关。本研究构建了pET28a-GhCYP714A1原核表达载体并进行体外诱导表达,获得分子质量约为57.31 kDa的重组蛋白。将GhCYP714A1基因转化烟草验证其参与活性氧产生的功能,与非转基因的野生型烟草相比,转基因烟草叶片中具有较高的H_2O_2累积。本实验结果为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础。     

凡纳对虾penaeidin2抗菌肽基因的克隆与性质研究

抗菌肽分子是无脊椎动物先天免疫系统中,直接发挥免疫效应的分子;它在对抗病原细菌侵染的过程中发挥着重要的功能.本文以凡纳对虾对虾素抗菌肽基因penaeidin2作为研究对象,系统地进行了基因克隆、氨基酸序列比对、分子进化关系以及分子结构的初步预测等研究.研究结果显示:Lva-pen 2基因是一个免疫反应相关基因,它在凡纳对虾的先天免疫系统中发挥着重要功能.     

梅花鹿FGF10基因的生物信息学分析

应用生物信息学的方法对梅花鹿FGF10基因的核苷酸和氨基酸序列进行了初步的生物信息学分析,包括理化性质分析、信号肽和跨膜结构域分析、磷酸化位点和疏水性分析、蛋白质二级结构分析、功能结构域分析以及系统进化分析.结果表明:梅花鹿FGF10基因编码213个氨基酸,蛋白相对分子量为23.84kD,为碱性不稳定蛋白;存在信号肽和跨膜结构域;共有26个磷酸化位点;二级结构主要由α螺旋、β转角、延伸链和随机卷曲组成.具有FGF典型的FGF结构域.系统进化分析显示,梅花鹿FGF10与哺乳动物FGF10相似性较高,并且与牛、羊在亲缘关系上最相近.为梅花鹿FGF10基因的结构和功能的进一步研究打下了坚实的理论基础.     

大熊猫核糖体蛋白L34基因cDNA克隆与蛋白特性

为进一步研究RPL34的结构基因,也为更深入开展大熊猫分子生物学研究积累科学资料,本研究采用RT-PCR方法,首次成功克隆了大熊猫的核糖体蛋白L34基因的cDNA序列,对克隆序列进行了测序及初步分析,并利用RPL34蛋白构建系统树.结果表明:大熊猫RPL34基因的表达序列全长为379 bp,ORF为354 bp,编码117个氨基酸的蛋白质,该蛋白分子量为13.292 9 kD,等电点(pI)为11.48,含有5种类型共11个功能位点.进一步分析发现,该基因与已报道的人、牛、褐家鼠、小家鼠、非洲爪蟾和斑马鱼等物种的编码序列及其编码的氨基酸序列同源性很高,蛋白质分子量、pI非常接近,功能位点基本相同,说明核糖体蛋白L34基因及其编码蛋白在进化过程中非常保守;进化树分类结果与传统分类一致,表明L34蛋白能很好的反映物种间的进化关系.     

微泡菌ALW1褐藻胶裂解酶AlgL14的表达及信息学分析

以微泡菌(Microbulbifer sp.) ALW1的基因组为模板,使用褐藻胶裂解酶AlgL14特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p MD18-T载体后进行测序,并对该基因编码的蛋白质序列进行生物信息学分析。将目的基因插入pET-28α(+)表达载体,转入Escherichia. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达,并利用亲和层析进行重组蛋白纯化。结果显示,克隆基因的大小为1 350 bp,预测编码含有449个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质序列与其他菌株来源的褐藻胶裂解酶序列具有一定的相似性,预测克隆的目的基因编码褐藻胶裂解酶,归属于PL-14家族。褐藻胶裂解酶AlgL14的理论分子质量大小为48. 772 ku,理论等电点为6. 27。采用同源建模法建立菌株ALW1褐藻胶裂解酶AlgL14的三维结构,富含β-折叠。将目的基因在E. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达,并纯化获得重组褐藻胶裂解酶。SDS-PAGE分析显示,表达的目的蛋白分子质量约为48. 8 ku。     

烟草质体分裂相关基因NtFtsZ cDNAs的克隆及功能分析

通过RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)方法从烟草中克隆了两个质体分裂相关基因NtFtsZ1-1和NtFtsZ1-2的cDNA.推导的氨基酸序列分析表明,两者均具有FtsZ蛋白的典型特征和GTP结合位点;N端氨基酸序列分析也表明,NtFtsZ1-1和NtFtsZ1-2都具有质体导肽特征,发现了在高等植物中至少存在两个具有质体导肽的FtsZ;基于氨基酸序列的分子谱系分析也支持这一结果.核酸杂交表明两者在植物的不同发育时期具有相似的表达谱.将这两个基因转入E.coli中表达,它们能影响宿主菌的正常分裂,初步验证了其功能.这些研究提示在高等植物中FtsZ可能具有更多样化的功能.     

大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因（rps15A）的克隆及序列分析

根据已报道的部分物种的核糖体蛋白S15A亚基基因(rps15A)的相关信息设计引物, 运用RTPCR和TouchdownPCR技术, 分别克隆了大熊猫核糖体蛋白S15A亚基的cDNA和结构基因序列, 并进行测序及分析. 结果表明: 大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因的表达序列全长为460 bp,开放阅读框(ORF)为393 bp, 编码130个氨基酸, 结构基因序列全长为6091 bp, 含有4个外显子和3个内含子. RPS15A蛋白的相对分子质量为14.84 kD, pI为10.62. 拓扑预测显示含有5个类型的功能位点, 即: 1个依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点, 2个蛋白激酶C磷酸化位点, 1个乙酰化位点, 1个N 糖基化位点及1个核糖体蛋白S8 signature位点. 进一步对RPS15A蛋白的结构分析及其与部分脊椎动物和果蝇RPS15A蛋白的同源性分析, 发现该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性, 这表明真核生物核糖体蛋白亚基S15A在进化中具有较高的保守性.     

白菜防御素基因的预测及结构功能分析

采用生物信息学的方法,通过已知防御素基因家族基因氨基酸序列在线Blast相似性比对,对白菜(Brassicarapa)基因组中防御素基因进行了预测和鉴定,分析了防御素基因在进化过程中各部分结构,包括上游区域、启动子区域、外显子区域、内含子区域以及UTR区域的结构变异以及功能变异,对该基因上游序列顺式作用元件和表达模式进行了预测。分析结果表明,白菜防御素基因编码60～80个氨基酸短肽,编码氨基酸均具有8个保守的半胱氨酸;白菜防御素基因功能结构域保持相对稳定,但部分基因成员前端信号肽序列出现变异;内含子长度出现增长、缩短、消失等3种变异模式;该基因上游启动子区域核苷酸变异较其他区域显著,上游序列顺式作用元件大多与光应答、逆境胁迫应答和信号分子应答相关。该基因表达模式预测结果表明白菜防御素基因在进化过程中可能出现分化,主要体现在基因沉默和表达部位的差异。     

基于8-氨基1,3,6-萘三磺酸二钠盐的糖基化蛋白质标记方法

发展了基于荧光试剂8-氨基1,3,6-萘三磺酸二钠盐(ANTS)的糖基化蛋白质选择性标记和荧光检测的新方法.实验中以标准蛋白质细胞色素c和核糖核酸酶b为样品,优化了pH和反应时间.在优化的条件下,核糖核酸酶b的检测灵敏度可提高22倍,而非特异性的标记仅为1％,显示了这种衍生方法极好的选择性.进一步将该方法应用于卵清蛋白的衍生,通过结合二氧化钛(TiO2)亲和富集,共鉴定到14个蛋白质,其中超过85％的蛋白质具有一致的N-X-T/S(X为除脯氨酸以外的其他氨基酸)序列,为潜在的糖基化蛋白,进一步验证了该方法的高选择性.     

甘蓝型油菜SHR蛋白基因鉴定与结构分析

植物SHR蛋白属于GRAS蛋白转录因子家族,保守羧基端含有VHIID结构域,氨基端不保守,参与调控植物物质合成和生长发育.参照拟南芥At SHR基因的CDS序列,采用生物信息学的方法在甘蓝型油菜数据库中鉴定出3个Bn SHR基因,进而分析其基因结构、生化特性、进化关系和蛋白结构.研究结果显示3个Bn SHR基因中有2个位于C基因组(来源于甘蓝)上,1个位于A基因组(来源于白菜);3个Bn SHR基因的氨基酸序列一致性为88.25%,与At SHR基因在进化上也高度同源,SHR基因在结构和功能上保守;亚细胞定位预测显示Bn SHR蛋白可能定位于过氧化物酶体,参与种子萌发过程中脂肪转变为糖分的过程;PHYRE2预测了Bn SHR蛋白的三级结构,由于序列的差异性导致了氨基末端处结构相差较大,但VHIID保守区结构类似,为β-折叠.