bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor,简称bFGF）的真核表达载体，以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用，应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1上，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况，酶切，PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性，免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结果表明已成功构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1-bFGF，并且bFGF能够在3T3细胞表达。     

含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的家蚕同源重组质粒载体的构建

以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG350为出发质粒，插入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体pMD-Fib-IE-EGFP，通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插入到原始质粒中，通过脂质体介导法转染胃癌细胞能发出很强的绿色荧光，表明该质粒能够在真核细胞中表达，为进一步建立完善的家蚕转基因系统平台提供基因材料。     

增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建

构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的真核表达载体pCDNA3．1( )-EGFP,转染至培养的Hela细胞中成功表达,并发出绿色荧光,证明EGFP一种良好的报告基因和筛选标记．     

透明质酸合成酶2真核表达载体的构建及表达

构建了透明质酸合成酶2真核表达载体,并观察其在真核细胞中的表达。利用RT-PCR法从MG63细胞总RNA中扩增,获得人透明质酸合成酶2cDNA,并克隆至真核表达载体pEGFP-N3,将经双酶切鉴定和DNA测序证实的阳性重组子命名为pEGFP-N3-HAS2。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。双酶切鉴定和DNA测序证实成功构建pEGFP-N3-HAS2真核表达载体。转染HEK293细胞后可见HAS2-EGFP融合蛋白高表达并定位于浆膜。该载体的成功构建为进一步探讨透明质酸合成酶2在治疗骨性关节炎、修复关节软骨缺损中的应用价值奠定了基础。     

甜味蛋白thaumatin表达载体的构建

将克隆在不同质粒上的thaumatin基因的两个片段连接起来，连接产物克隆到质粒pUC18上．测序结果表明，连接产物是一个完整的thaumatin cDNA基因．将此基因通过基因重组技术，克隆到植物表达载体pBI121中，构建了一个新的转化植物的表达载体-pBIl21-tha.     

EGFP-IgG4融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）和IgG4基因的融合蛋白真核表达载体pMM-EGFP-IgG4/WG,转染至中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)中成功表达,并发出绿色荧光,证明pMM-EGFP-IgG4/WG是一种良好的生产分泌型外源融合蛋白的阳性对照.     

携带p53基因重组腺病毒载体的构建

将pCMVp53重组转移载体经BamHI和NheI酶切,得到p53基因cDNA,然后将cDNA片段克隆到转移载体pCMV5GFP,使其受CMV5启动子的调控,获得pCMV5p53重组转移载体.用该线状重组转移载体与腺病毒右臂DNA经磷酸钙共转染293细胞获得重组腺病毒,经酶联免疫吸附法(ELISA)测定p53蛋白含量,证明外源p53基因在含重组腺病毒的293细胞中得到表达.     

重组人截短型IL—6表达载体的构建及表达

旨在建立人截短型IL-6原核高效表达系统。用PCR方法获得截短的人IL-6基因（rhIL-6cDNA）,将其插入克隆载体pUC18中,经证实后再克隆入表达载体pBV220中,鉴定阳性表达载体。结果建立了截短型IL-6基因的克隆载体,经测序证实完全正确;构建了截短型IL-6的原核表达质粒pBV220/rhIL-6并获得高效表达;初步纯化的表达蛋白的比活性为5×10     

pBK-CMV⊿-EGFP-SNAT2质粒载体构建及其表达鉴定

SNAT2是SLC38基因家族编码的Na＋偶联中性氨基酸转运蛋白中属于systemA的成员之一．它在谷氨酸一谷氨酰胺循环、肝脏糖质新生等生物通路中发挥重要作用．增强型绿色荧光蛋白EGFP的连接对于SNAT2在细胞表达中的定位以及检测都有很大的帮助．采用PCR扩增和酶切技术将EGFP连接到质粒pBK-CMV△-SNAT2中SNAT2的N端．通过酶切后琼脂糖凝胶电泳和测序验证得到pBK-CMV△-EGFP—SNAT2质粒载体,将构建好的质粒瞬时转染进人胚肾细胞（HEK293cells）用Westernblot和激光共聚焦电子显微镜检测EGFP-SNAT2的表达与亚细胞定位．结果表明：EGFP．SNAT2在细胞中正确表达并定位于细胞膜上．pBK．CMV么．EGFP．SNAT2质粒载体的构建对于进一步研究SNAT2的结构和功能具有重要意义．     

重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因工程菌的构建与表达

人心肌肌钙蛋白Ⅰ(hcTnI)是临床检测心肌损伤及预后提供诊断的生物学指标,由于来源有限,采用基因重组技术,以期获得高表达量的人心肌肌钙蛋白Ⅰ.人工合成hcTnI基因,将其插入pET-11a载体中,通过酶切鉴定正确后转入表达宿主菌BL21(DE3)中,诱导表达目的蛋白.采用蛋白免疫印迹反应(Western Blot,WB)鉴定表达目的蛋白的免疫特异性.经SDS-PAGE证实重组蛋白的相对分子质量约为2.6×104,凝胶密度扫描软件检测到目的蛋白占总蛋白比例为30.1%,WB实验验证诱导后目的蛋白特异性良好.成功构建了重组hcTnI基因在大肠杆菌表达的工程菌株,并获得表达,为制备高特异性的抗体及临床检测应用和测定标准化奠定了基础.     

促血管生成素载体构建及在癌细胞中的表达

[目的]构建人促血管生成素-2(Ang-2)基因的重组peDNA3真核表达载体,为进一步研究Ang-2在肿瘤血管生长上的作用奠定基础．[方法]从人胎盘组织中提取Ang-2总RNA,经过RT-PCR扩增、TA克隆、酶切鉴定、DNA序列分析后,将纯化的Ang-2基因克隆到pcDNA3真核表达载体上,转染Hela细胞,应用RT-PCR方法鉴定细胞表达的mRNA．[结果]RT-PCR得到的产物经DNA测序,与Genebank中人Ang-2eDNA序列一致;构建人Ang-2真核表达载体,转染人Hela细胞,细胞表达Ang-2目的基因mRNA。[结论]成功构建人Ang-2基因真核表达载体pcDNA3-Ang-2．     

Red/ET同源重组系统介导的质粒载体快速构建

Red/ET重组技术是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,该技术简便、快速.首先,通过一步融合的方法将链霉素抗性基因和氯霉素抗性基因同时克隆至pUC19上,从而构建出含有正反选择标记的载体pRC;其次,用安普霉素抗性基因或者氯霉素抗性基因替换了常用表达载体pET-28b上的卡那霉素抗性基因,改变了其抗性选择标记,得到的表达载体pMT和pCT可以更广泛地应用于不同宿主中;最后,还将启动和终止表达的区域定点插入pACYC184载体中,使其成为可以独立表达蛋白的表达载体p184.本研究所得到的载体为大肠杆菌宿主菌中的基因克隆和蛋白表达提供了基础.     

植物甜蛋白thaumatin基因重组表达质粒的构建

利用NDA重组技术,将植物甜蛋白thaumatin基因克隆至植物表达载体pBI121中,成功地构建了重组植物表达质粒pBI121-th。     

重组降血压肽多肽序列的设计及表达系统构建

通过分析降血压肽结构与功能的关系,设计并合成5条降血压肽序列,通过活性测定以及体外消化试验,确定P3（六肽）为理想降血压肽,为实现该小肽在大肠杆菌中的表达,经特定酶切位点将其串联为6拷贝的融合多肽,将相应的基因序列克隆至表达载体pGEX-4T-2并转化至宿主茵Escherichia coli BL21中,双酶切、PCR以及测序结果均表明成功构建了重组质粒pGEX-4T-2-ACEIP。     

球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表达载体的构建

本研究针对球孢白僵菌的tps1基因,通过双酶切和T4连接,构建了tps1基因的真核表达载体pPIC9K/tps1。PCR鉴定和测序表明,该重组质粒包含了球孢白僵菌tps1基因的全长cDNA序列。并且Bbtps1基因被正确地插入到了pPIC9K质粒的表达框中。因此,该重组质粒可以直接用于tps1基因的酵母表达。     

球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表达载体的构建

本研究针对球孢白僵菌的tps1基因,通过双酶切和T4连接,构建了tps1基因的真核表达载体pPIC9K/tps1.PCR鉴定和测序表明,该重组质粒包含了球孢白僵菌tps1基因的全长cDNA序列.并且Bbtps1基因被正确地插入到了pPIC9K质粒的表达框中.因此,该重组质粒可以直接用于tps1基因的酵母表达.     

结核分枝杆菌ESAT6基因真核表达载体的构建及表达

为了研究结核杆菌毒力因子ESAT6在结核杆菌感染细胞过程中的功能。采用分子生物学方法,根据Gen-Bank中登录的结核杆菌H37Rv的ESAT6基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到ESAT6基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测序验证后,再将ESAT6基因亚克隆至pEGFP-N1中,经核苷酸序列测定和酶切鉴定获得重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6。用重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6转染293T细胞。结果显示:重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6测序结果正确,转染细胞后出现绿色荧光,经Western blot分析鉴定,可见约35kDa的预期蛋白条带,证实ESAT6-EGFP融合蛋白在293T细胞中获得了表达。研究结果为进一步研究毒力因子ESAT6在感染宿主细胞中所发挥胞内生存机制奠定了基础。     

BCR/ABL和SEA双基因重组载体的构建和表达

目的:构建和表达含BCR/ABL融合基因和葡萄球菌肠毒素A(SEA)的真核双表达质粒.方法:利用RT-PCR技术从K562细胞中扩增出含BCR/ABL融合位点基因片段,提取金黄色葡萄球菌基因组DNA扩增出SEA基因,分别将两基因片段连在pIRES载体的多克隆位点A和B上,构建BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA- pIRES-BCR/ABL重组质粒.将重组质粒转染K293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒在真核细胞的转录情况, SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白在真核细胞的表达.结果:成功扩增出BCR/ABL和 SEA基因片段;双酶切鉴定BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL重组质粒中含有BCR/ABL和SEA基因,测序证实完全正确;将重组质粒转染K293细胞后,经 RT-PCR扩增鉴定,插入到重组质粒的BCR/ABL和SEA基因能在真核细胞正常转录,经SDS-PAGE电泳鉴定重组质粒能够在真核细胞中表达BCR/ABL和SEA蛋白.结论:成功构建BCR/ABL-pIRES-SEA、SEA-pIRES-BCR/ABL真核双表达质粒,可在真核细胞中正常转录并表达BCR/ABL和SEA蛋白.