重组人肿瘤坏死因子蛋白TNF-α的纯化与功能鉴定

 串联亲和纯化系统（TAP）是近年来广泛使用的一种可在接近于生理条件下探究蛋白间相互作用的生化纯化方法。目前许多关于TAP 的研究报道均使用细胞内转录因子为目标蛋白,探索细胞内与其相互作用的蛋白分子。本文尝试建立一种细胞外配体-受体刺激介导的信号转导初始复合体的纯化体系,为此选择了一种多功能的免疫分子配体蛋白--肿瘤坏死因子蛋白超家族（TNFSF）中的核心成员TNF-α。TNF-α 是一个强效促炎因子,可介导炎症反应、细胞凋亡和激活等生理效应,是至今研究最多的TNFSF 成员。利用原核表达系统纯化出了一种带有多个标签的重组人源TNF-α 蛋白,通过检测其受体下游信号通路鉴定该蛋白与天然TNF-α 蛋白的生理活性相似,从而证明该蛋白可以用于胞外TAP 系统探究TNFR 下游信号通路,为配体-受体刺激介导的信号转导初始复合体的胞外串联亲和纯化系统的建立奠定了基础。     

重组人肿瘤坏死因子粗提取工艺的研究

通过研究重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)的粗提取工艺中各操作条件对目标蛋白纯化的影响,发展了一条纯化rhTNF-α的集成化工艺.该工艺组合细胞破碎,热变性与硫酸铵分级沉淀,有效节省离心步骤,缩短工艺流程,所得粗提物中目标蛋白占总蛋白含量的57%,目标蛋白回收率为90.3%,活性回收率为85.8%,各项指标均比未集成的工艺有较大程度的提高.     

柱层析法纯化重组人肿瘤坏死因子α及其抑癌作用

半合成人肿瘤坏死因子ＴＮＦ－α在大肠杆菌中高表达．发酵后收集菌体经超声破碎，然后在１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心１０ｍｉｎ，上清经６０℃热处理３０ｍｉｎ，离心上清用６０％饱和度的硫酸铰沉淀，再依次经过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ—２５、ＤＥＡＥ—５２纤维素和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ—７５柱层析，得到的纯化ｒｈＴＮＦ—α比活性为２×１０７ｕ／ｍｇ，回收率为２４％．经过ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳和ＨＰＬＣ鉴定，纯度达９５％左右，分子量为１７×１０３．ｒｈＴＮ—α对热稳定性试验表明，—２０℃下贮存一年或者０℃下贮存一个月，ｒｈＴＮＦ—α活性仍保留５０％．人胃癌和肝癌细胞株的体外抑瘤试验和接种小鼠的活体抑瘤试验表明，本实验取得的ｒｈＴＮＦ—α具有明显的抑瘤生长作用．     

柱层析法纯化且人肿瘤坏死因子α及其抑瘤作用

半合成人肿瘤坏死因子ＴＮＦ－α在大肠杆菌中高表达，发酵后收集菌体经超声破碎，然后在１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心１０ｍｉｎ，上清经６０℃热处理３０ｍｉｎ，离心上清用６０％饱和度的硫酸铵沉淀，再依次经过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５，ＤＥＡＥ－５２纤维素和Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ－７５柱层析，得到的纯化ｒｈＴＮｆ－ａ比活性为２×１０＾７ｕ／ｍｇ，回收率为２４％，经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和ＨＰＬＣ鉴定，纯度达９５     

人新型肿瘤坏死因子在E.coli中的高效表达、纯化及诱导凋亡活性

采用PCR技术获得了新型的人肿瘤坏死因子基因，在153位氨基酸处引入突变，使Gly突变为Leu.将突变体hTNF基因克隆到表达载体pQE30中，SDS-PAGE结果显示经IPTG诱导后,hTNF基因获得大量表达，通过Ni金属螯合层析柱亲和层析获得到纯化的hTNF融合蛋白，Western blot结果表明hTNF蛋白可与抗TNF的抗血清知识性发生特异性反应，荧光染色实验检测了hTNF蛋白诱导细胞发生凋亡的活性。     

免疫亲和层析纯化兔抗人IgG

用人IgG-Sepharose 4B亲和柱,3mol/L氯化镁洗脱,一步纯化免抗人IgG血清,获得了SDS-PAGE电泳纯,免疫双扩散法效价达1/256,收率62.6%;用8mol/L脲洗脱,效价为1/128,收率34.1%.与硫酸铵多步沉淀法比较,纯度和效价大大提高,为获得高度特异、高亲和力兔抗人IgG提供了一条简便途径.     

肿瘤坏死因子与临床检测

肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)最早是从巨噬细胞中发现的仅杀伤癌细胞而不损伤正常细胞的因子,它能激活中性粒细胞并刺激其产生超氧化物,释放溶酶体酶,从而提高杀灭微生物的活性.TNF水平测定对于某些疾病的诊断、判断预后及指导用药均具有重要意义.本文就这几方面国内外研究近况综述如下:一、TNF来源、特点、生理作用TNF-α最早由Carswell等于1975年首先报道的,1984年Penica等分离表达了人的TNF-α的cDNA.目前,人们根据TNT的来源暂分为三种:一是由活化的单核或巨噬细胞分泌产生的称为TNF-α;二是由活化的T-淋巴细胞分泌产生的称为TNF-β;三是由NK细胞分泌产生的称为TNF-γ.人TNF-α是由3个分子量为17KD的单体通过1个二硫键非共价组成的,含有157个氨基酸的非糖蛋白;人TNF-β则是由171个氨基酸组成的、分子量为25KD的糖蛋白,分子内无半胱氨酸.TNF的生物学效应是:适量的TNF可调节机体的免疫及代谢功能,增强机体对入侵病原体的抵抗力,对维持机体内部的稳定状态及抵制各种致病因子的侵袭具有重要意义.但是,TNF的过量表达则与机体的炎症、感染、机体损伤等病理状态有关.TNF-α诱导的各种细胞反应是通过与细胞表面两类特异性受体相互作用而产生的,即55KD的TNF受体(TNF receptor,TNF R_1)和75KD     

重组免疫球蛋白恒定区-肿瘤坏死因子受体II的应用研究

目的基因经pEE12.4质粒扩增,脂质体Free Style TM MAX转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO-细胞),构建出细胞株.细胞株经50μmol/L L-Methionine Sulfoximine加压筛选、培养基、添加剂等优化后,最终获得活性蛋白表达量高达58.54mg/L的细胞株,培养液纯化后,目的蛋白在SDS-PAGE为一条带,HPLC纯度为96.5%.     

与肿瘤坏死因子—α—有关的抑制物（综述）

与肿瘤坏死因子－α有关的抑制物（综述）唐海兰（暨南大学医学院组织胚胎学教研室，５１０６３２，广州）关键词：肿瘤坏死因子；免疫；抑制中图分类号：Ｒ３４－２肿瘤坏死因子－α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ－α）是机体免疫系统中产生的最重要的细胞因...     

人肿瘤坏死因子穿梭表达载体的构建

应用ＤＮＡ重组技术,将人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ）ｃＤＮＡ插到质粒ＰＲＬ４３９的ＰｐｓｂＡ启动子下游,得到中间载体ＰＲＬ＿ＴＮＦ;再把ＰＲＬ＿ＴＮＦ上含ＰｐｓｂＡ和（ｒｈＴＮＦ）ｃＤＮＡ的片段连到穿梭载体ＰＤＣ＿８上,构建成穿梭表达载体ＰＤＣ＿ＴＮＦ．转化大肠杆菌ＴＧ１后,进行发酵培养．ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ分析和免疫印迹检测结果显示ｒｈＴＮＦ获稳定表达,分子量为１７ｋｕ．本研究结果为ｒｈＴＮＦ在蓝藻中的表达提供了技术基础．     

昆虫细胞杆状病毒表达人生长激素的纯化及性质研究

在昆虫细胞杆状病毒中表达的人生长激素，经CM－52离子交换柱层析和Phenyl-Sepharose CL-4B疏水柱层析后，去除了93％杂蛋白。再用CNBr-activated Sepharose 4B亲和柱层析的方法，获得高纯度的生长激素样品。SDS－PAGE结果表明，纯化样品在SDS－PAGE图谱呈现一条带，分子量为22kD。Western杂交结果表明，纯化样品与生长激素标准品有相似的免疫活性。胰肽图谱分析结果显示纯化样品和标准品具有相同的一级结构。DNS－CL测N末端表明，纯化样品的N末端为苯丙氨酸，所有这些性质均与天然人生长激素相同。     

rhBMP-6的表达和纯化

骨形态发生蛋白(bone　morphogenetic protein，BMP)—6属于转化生长因子(transforming growth fac-tor)—β超基因家族，在骨的形成中具有重要作用，并受雌激素选择性上调．本研究利用RT—PCR从人胎盘组织中扩增BMP—6成熟肽的DNA片段，克隆到pGEx—5x—1中，构建GST—BMP6融合蛋白表达载体pGEx—BMP—6，转化E.coli DH5a．克隆质粒转化的工程菌，经IPTG诱导4h后，高效表达GST—BMP6融合蛋白，在SDS—PAGE上出现一新蛋白带，分子量约为42kD，约占总蛋白的25％，表达产物以包涵体形式存在．菌体超声破碎，经0．3％N—十二烷基肌氨酸钠(SKL)溶解包涵体，离心后的上清液加入0．6％　Triton　x—100整合SKL，然后利用谷胱甘肽Sepharose—4B亲和层析纯化．结合GST—BMP6的介质经洗涤、xa因子酶切得到纯度达95％的rhBMP—6蛋白。     

一步法合成Cs2REI5（RE=Ce,Pr）

用一步法合成了2个新化合物Cs2CeI5和Cs2PrI5，测试了这2个化合物的荧光性质，初步确定了Cs2CeI5和Cs2PrI5的结构，它们都属于四方晶系，是同型物（晶胞参数Cs2CeI5:a=1．0566nm，c=0.8729nm；Cs2PrI5:a=1.0543nm，c=0．8704nm）．并且还用XANES法测定了Cs2PrI5中Pr的价态．     

探测人体皮下肿瘤的微波成像新方法

本文讨论了一种人体皮下肿瘤的微波成像新方法。矩形波导探头与人体直接接触，利用时域有限差分法对人体组织模型进行计算得到探头的微波反射系数。     

用PAT和受体结合分析研究TNF的结构特征

用正电子湮没技术（ＰＡＴ），受体结合分析和Ｌ９２９细胞活力测定等方法研究了天然型ｈＴＮＦ－α和突变型ｈＴＮＦ－ｂ肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）的结构特征。实验结果表明，在ＴＮＦ－α中的正电子湮没长寿命（τ２）和相应强度（Ｉ２）分别大于和小于ＴＮＦ－ｂ的τ２和Ｉ２，用受体的放射配基结合分析，ＴＮＦ－ｂ对ＨＥＰ－２（仅表达ＴＮＦ－Ｒ５５）和Ｕ９３７（主要表达ＴＮＦ－Ｒ７５）的ＩＤ５０分别比ＴＮＦ－α低１／２和高４０倍。由此可得到一个有意义的结论，ＴＮＦ－ｂ的分子间自由体积减小，导致它的密度和细胞毒活性增大     

用离子色谱法测定人尿中的草酸

本文叙述了一种使用离子色谱技术测定人尿中的草酸的新方法。该方法只需要简单的样品制备:尿样用盐酸酸化,用去离子水按需要稀释,最后通过0.2μm孔径的微孔滤膜过滤就能直接注入离子色谱仪分析。本方法每分析一个尿样仅需10min,在稀释后的尿样中草酸的低检测限为0.1ppm(1.1μmol/l),用标准加入法获得的草酸平均回收率为100.28%。我们使用本方法测定了300多个尿样中的草酸,其线性范围为1～1000ppm,相对标准偏差为4%。本方法可以用于人尿中草酸的直接测定。