人类Ec109细胞系基因文库的建立及其鉴定

人Ec109细胞株是在肿瘤基础和临床研究中应用较广的一个食管癌细胞系。我们继从食管癌实体肿瘤的基因文库HEC—S—1成功地克隆了人c-Ha-ras1原癌基因之后,     

碳代谢总体调控蛋白CRP对nifU启动子的抑制作用不依赖于该启动子上游CRP与NifA竞争的靶位点

在大肠杆菌中，碳代谢总体调控蛋白CRP抑制肺炎克氏杆菌nifU启动子的表达，序列分析表明，nifU启动子上游有一个CRP靶位点，且该位点与已知的NifA靶位点重合，体外凝胶阻滞实验结果表明，CRP对该位点的亲和性与对乳糖操纵子的CRP靶位点相似，说明在生理条件下，CRP可与NifA激活蛋白竞争该靶位点，该位点突变的体外凝胶阻滞实验结果表明，CRP不再与突变的nifU启动子结合，体内活性检测结果显示，在组成性表达NifA的激活下，CRP对上游CRP靶位点突变的nifU启动子依然有抑制作用，其程度与野生型启动子无明显差异，因此，CRP对nifU启动子的抑制作用不依赖于该启动子上游特异的CRP靶位点，暗示CRP与Eσ^54RNA聚合酶间的直接相互作用在该抑制效应中起着主要作用。     

拟南芥防卫基因 PDF1.2启动子中GCC盒应答茉莉素反应必要的顺式作用元件

通过对PDF1.2启动子进行缺失突变和点突变,结合在烟草叶片中的农杆菌瞬时表达,分析了该启动子中应答茉莉素反应的必要顺式作用元件,验证了该基因上游1861 bp的区域具有应答茉莉素反应的功能.通过缺失突变证实了该启动子-300和-234 bp间的区域是该启动子应答茉莉素反应的重要区域.为了进一步阐明此重要区域中的应答茉莉素反应的必需区域,分别对此区域中的GCC盒、类G盒和一个回文序列进行了点突变.在烟草叶片中的瞬时表达分析表明,GCC盒的突变使该启动子丧失了对MeJA的应答,而类G盒和回文序列的突变没有明显的改变该启动子区域对茉莉素的反应,表明GCC盒是PDF1.2基因启动子中应答茉莉素反应的必需顺式作用元件.在此基础上,将含有4次重复GCC盒序列的片段与CaMV 35S的最小启动子序列构建成嵌合启动子.在烟草叶片中,该嵌合启动子可应答茉莉素的诱导反应,表明GCC盒是PDF1.2基因启动子中应答茉莉素反应必要的顺式作用元件.     

家蚕(苏·菊×明·虎)幼虫血清蛋白基因(BmLSP)启动子特性分析

从家蚕品种苏·菊×明·虎基因组DNA中克隆了家蚕幼虫血清蛋白基因(1arval serum protein,Bombyx mori,BmLSP)的调控序列,涵盖了第1内含子、第1外显子、启动子区和上游区.通过PCR技术与限制性内切酶酶切方法,以荧光素酶(luc)为报告基因,构建了一系列缺失不同调控元件的报告质粒,在家蚕BmN细胞瞬时表达系统中进行了BmLSP启动子的特性分析.结果表明,含第1内含子和家蚕丝素轻链基因同源区序列的BmLSP启动子活性分别比缺失相应序列的启动子活性提高5.8和4.4倍,暗示该两段调控序列中含有增强启动子活性的调控元件.上游区失活的部分水手转座子元件对BmLSP启动子活性有一定的抑制作用.此外,外源昆虫保幼激素类似物(JHA)呈现剂量依赖效应,低浓度处理增强启动子活性,高浓度处理起抑制作用;而蜕皮激素(MH)对其活性没有显著影响.     

鼠伤寒沙门氏菌purB受purR调控的实验证据

通过遗传图和序列同源性分析获得了鼠伤寒沙门氏菌purB核苷酸序列。为揭示鼠伤寒沙门氏菌purB是否受purR调控,对purB基因的PUR box进行了功能分析。PCR扩增野生型PUR box和其第14位保守碱基发生突变（C→T）的DNA片段。分别与从鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株LT2提取的P urR粗制品进行了凝胶阻滞实验。结果表明,purB基因的PURbox与PurR阻遏蛋白有很好的结合能力,而突变的PUR box则不能与PurR阻遏蛋白结合。可见,野生型鼠伤寒沙门氏菌purB与嘌呤从头合成途径中其他结构基因一样是受purR基因协同调控的。此外还对不受调控的实验现象的机制做了研究。结果表明purB组成型表达是purB::MudJ基因融合发生在PUR box上游（－554bp)的结果。这一结果还为鼠伤寒沙门氏菌purB基因与其上游ycfC基因属于同一操纵子提供了有力的证据。     

拟南芥防卫基因PDF1.2启动子中GCC盒是应答茉莉素反应必要的顺式作用元件

通过对PDF1.2启动子进行缺失突变和点突变, 结合在烟草叶片中的农杆菌瞬时表达, 分析了该启动子中应答茉莉素反应的必要顺式作用元件, 验证了该基因上游1861 bp的区域具有应答茉莉素反应的功能. 通过缺失突变证实了该启动子-300和-234 bp间的区域是该启动子应答茉莉素反应的重要区域. 为了进一步阐明此重要区域中的应答茉莉素反应的必需区域, 分别对此区域中的GCC盒、类G盒和一个回文序列进行了点突变. 在烟草叶片中的瞬时表达分析表明, GCC盒的突变使该启动子丧失了对MeJA的应答, 而类G盒和回文序列的突变没有明显的改变该启动子区域对茉莉素的反应, 表明GCC盒是PDF1.2 基因启动子中应答茉莉素反应的必需顺式作用元件. 在此基础上, 将含有4次重复GCC盒序列的片段与CaMV 35S的最小启动子序列构建成嵌合启动子. 在烟草叶片中, 该嵌合启动子可应答茉莉素的诱导反应,表明GCC盒是PDF1.2 基因启动子中应答茉莉素反应必要的顺式作用元件.     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.     

PHF2全长cDNA及剪接异构体的克隆鉴定

ＰＨＤ锌指结构蛋白作为ＨＯＸ基因的上游调控因子,在生物体的发育过程中起着重要作用涉及该蛋白的异常还与人类的某些恶性疾病如白血病相关,利用基因数据库同源性比较,ＰＣＲ扩增ｃＤＮＡ文库筛选ｃＤＮＡ及部分基因组ＤＮＡ序列分析,多组织Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交等方法,克隆鉴定了一种新的人类编码ＰＨＤ蛋白的全长ｃＤＮＡ及该基因的不同剪接异构体。     

牛金属硫蛋白基因序列测定及结构分析

金属硫蛋白(Metallothionein,简称MT)是一类能特异性地结合重金属,并富含半胱氨酸的低分子量蛋白质,它们广泛地存在于从酵母到人类的真核细胞生物体中。MT基因是动物细胞基因表达调控中一直受人重视的实验模型。为了在转基因家畜的研究中提供可诱导的调控元件,我们克隆了牛金属硫蛋白基因(bMT),并发现牛的MT基因家族至少含有4个成员。本文对其中一个具有功能的基因(bMTc)进行了序列测定,在此基础上对该基因的结构特性作了分析。     

家蚕(苏·菊×明·虎)幼虫血清蛋白基因(BmLSP)启动子特性分析

从家蚕品种苏·菊×明·虎基因组DNA中克隆了家蚕幼虫血清蛋白基因(larval serum protein, Bombyx mori, BmLSP)的调控序列, 涵盖了第1内含子、第1外显子、启动子区和上游区. 通过PCR技术与限制性内切酶酶切方法, 以荧光素酶(luc)为报告基因, 构建了一系列缺失不同调控元件的报告质粒, 在家蚕BmN细胞瞬时表达系统中进行了BmLSP启动子的特性分析. 结果表明, 含第1内含子和家蚕丝素轻链基因同源区序列的BmLSP启动子活性分别比缺失相应序列的启动子活性提高5.8和4.4倍, 暗示该两段调控序列中含有增强启动子活性的调控元件. 上游区失活的部分水手转座子元件对BmLSP启动子活性有一定的抑制作用. 此外, 外源昆虫保幼激素类似物(JHA)呈现剂量依赖效应, 低浓度处理增强启动子活性, 高浓度处理起抑制作用; 而蜕皮激素(MH)对其活性没有显著影响.     

STK11 基因在Peutz-Jeghers综合征家系中的突变分析

黑斑息肉综合征（Peutz-Jeghers syndrome，PJS）是一种常染色体显性遗传性疾病。最近，在19p13.3克隆出了PJS致病基因STK11(丝氨酸苏氨酸激酶)。为了进一步研究中国人PJS患者STK11基因的突变情况，应用变性高效液相色谱（DHPLC）和DNA测序方法，对3个多代PJS和3个散发性PJS家系中15例患者和20例正常成员的STK11基因的9个外显子进行了分析，在6个家系中共发现10个由碱基替代导致的点突变。有7个突变可使基因产物发生改变，包括1个无义突变、5个错义突变和1个移码点突变。分别发生在STK11基因的第37（CAG→TAG），123（CAG→CAT），161(ATT→AGT)，194（GAC→GAG）,245(CTC→TTC)和354位密码子（TTC→TTG）及第4内含子3′末端煎接位点部位（AG→AA）。在3个散发PJS家系中，有1个家系的患者，在第5外显子内存在错义突变，其余2个家系的患者，在内含子1（ 36）和内含子3（-51）均存在点突变。研究还发现，有3个多态位点，分别发生在内含子1（ 36），内含子3（-5）和内含子5（ 27）部位。以上结果表明，在PJS患者中存在较高频率STK11基因点突变，突变位点可分散在整个编码区。两代以上发病的家系突变频率较散发病例突变率高，提示STK11基因的改变与PJS的发病密切相关。     

转抗细胞凋亡基因p35黏虫细胞克隆株研究

通过脂质体介导的方法将抗细胞凋亡p35基因导入黏虫细胞系Ms7311, 经Zeocin抗性筛选和细胞克隆, 获得了转基因细胞株TMs7311. PCR检测证明, 转基因细胞株基因组DNA中含有p35基因特异扩增谱带. 该转基因细胞株形态与原始细胞系不同, 生长速度快, 群体倍增时间为25.4 h, 对磷酸缓冲液(PBS)有较强的营养抗性, 能抑制放线菌素D诱导的细胞凋亡; 病毒产量和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)以及碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase, SEAP)的表达水平明显高于原始细胞系Ms7311, 是一株高表达重组蛋白和高产杆状病毒的优良细胞株.     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

<正>人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.     

春化相关基因ver203FcDNA3′末端的克隆及序列分析

以差异筛选技术克隆到的春化相关基因cDNAverc2 0 3为基础 ,设计 5′端引物 ,利用RACE克隆策略 ,通过RT PCR扩增得到cDNA的 3′未端序列ver2 0 3F(1197bp) .Northernblot分析表明其全长约为 2 .0kb ,且其表达具有春化处理的特异性 .检索表明该基因序列(AB0 12 10 3)与一大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性 .推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介导的信号传导途径 .     

水稻穗顶退化突变体paa1331的鉴定及基因定位

水稻穗部是影响产量的重要农艺性状,其发育健全与否直接决定了水稻产量的高低.过去几十年已经有大量的粒型和穗粒数相关基因被克隆报道,但调控穗顶发育相关基因的克隆与功能的报道较少.本研究通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼稻品种宜香1B,筛选到一个能稳定遗传的穗顶退化突变体材料paa1331(panicleapical abortion1331).与野生型相比,该突变体主要表现为穗顶端严重退化(退化率高达53%),株高变矮,分蘖减少,穗粒数降低.台盼蓝染色结果表明,穗顶端退化伴随细胞程序性死亡;激素测定结果证明,突变体穗顶部生长素含量高于野生型.遗传分析表明,该突变性状受隐性单基因控制;通过图位克隆与重测序分析发现,基因LOC_Os04g40720第4外显子的碱基A突变成G,导致编码的氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸.目前该基因未见报道,暂将该基因定为候选基因.     

nifA突变的苜蓿根瘤菌在根瘤中的转录组学分析

用全基因组微阵列比较了根瘤中苜蓿根瘤菌1021的nifA突变菌和野生菌的基因表达谱. 分析结果表明, nifA的缺失引起601个基因的表达发生变化. 这些基因分别属于生物大分子的合成代谢、三羧酸循环及呼吸代谢以及结瘤固氮过程等多个功能组, 预示着根瘤中细菌的生长状态发生了显著的变化. 在根瘤中, fixK以及受其激活的基因在nifA突变菌中的表达量显著高于野生菌. 定量实时PCR分析表明, 根瘤中fixLJ的转录水平在nifA突变菌中显著高于野生菌. 通过统计学方法从13个表达发生显著变化的基因的上游调控序列中找到推测的NifA结合位点.     

一个水稻卷叶突变体rl_(11(t))的遗传分析和基因定位

水稻叶片形态相关突变体的挖掘是进行水稻功能基因组学研究和株型改良的重要基础.本研究从60Co-γ辐射的籼稻粤丰B后代中鉴定一个卷叶突变体,命名为rl11(t),该突变体表型为株高降低、叶片卷曲变窄、叶脉数目减少且发育异常,同时对生长素的敏感性降低.遗传分析表明,该突变性状受一个隐性单基因控制.利用SSR标记将卷叶基因定位在位于水稻第4染色体上RM6089和RM124之间,在该基因附近区域发展了32对新的STS标记,将Rl11(t)精细定位在BAC克隆AL606645上STS4-25和STS4-26之间,物理距离约为31.6kb,为最终克隆目标基因奠定了基础.     

巴西固氮螺菌鞭毛调节基因 flbD鉴定

克隆并测序了巴西固氮螺菌包括flbD基因在内的鞭毛基因簇片段。flbD突变株失去运动能力,不能合成极生鞭毛和侧生鞭毛（Fla^-Laf^-)。转入质粒携带的多拷贝flbD基因使该菌株恢复鞭毛和运动能力,但合成侧生鞭毛数目减少,在半固体平板上爬行圈比野生型的大。说明在巴西固氮螺菌中,FlbD对极生鞭毛和侧生鞭毛的合成调控起重要作用。     

两栖类、爬行类和鸟类存在一个新的Dmrt基因家族

果蝇Doublesex基因、线虫Mab-3基因和人类DMRT1基因均含有一个新的具有DNA结合能力的保守基序,即DM结构域。在性别决定和分化发育的调控过程中具有相似的功能。通过简并PCR克隆技术,扩增和克隆了不同进化地位的脊椎动物（东方蝾螈、秀丽锦龟、鹌鹑）基因组中的DM结构域。结果显示,具有DM结构域的基因形成了一个进化上保守的基因家族,具有5个基因亚族和16个基因成员。提示该类基因家族的复杂性。     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因全序列分析

在干旱和盐碱环境下,许多高等植物细胞中积累甜菜碱。一般认为甜菜碱是一种无毒渗透保护剂,它的积累使植物细胞在渗透胁迫下仍能维持正常功能。最近通过对玉米甜菜碱醛脱氢酶近等基因系的研究,为甜菜碱的这一重要生理功能提供了直接的证据。甜菜碱是由胆碱经过两步氧化反应生成。催化这两步氧化反应的酶分别是胆碱单氧化物酶(CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(BADH,EC1,2,1,8),从菠菜、甜菜、山菠菜、大麦和高梁中克隆了BADH cDNA,但BADH基因组序列尚未见报道。现已证明BADH mRNA的合成是受盐诱导的。为进一步研究BADH基因的结构特性和表达调控,本文构建了菠菜的基因组文库,克隆并分析了BADH基因全序列及5′端上游调控区序列。