新疆卡波氏肉瘤中c-myc、14-3-3β的表达

为探讨原癌基因c-myc、14-3-3β在新疆卡波氏肉瘤中的表达及意义，应用免疫组织化学Envision二步法检测新疆14例卡波氏肉瘤及对照组12例健康人正常皮肤组织内c-myc，14-3-3β的表达水平，结果显示：卡波氏肉瘤组织c-myc、14-3-3β蛋白均呈胞浆阳性，所有病例均呈阳性表达（14/14），阳性率均为100%；c-myc蛋白在正常皮肤组织中多数病例呈阴性表达（3/12），阳性率为25%，14-3-3β蛋白在正常皮肤组织中多数病例呈阴性表达（2/12），阳性率为16.7%，c-myc、14-3-3β蛋白在KS中的表达明显高于在正常皮肤组织中的表达，差异均有统计学意义（P〈0.01）。表明：c-myc1、4-3-3β蛋白的异常表达在KS的发展过程中可能发挥了重要作用。     

尼罗罗非鱼IgT重链的蛋白表达及表达分析

IgT（Immunoglobulin T）作为新型免疫球蛋白在粘膜免疫中具有重要作用. 文中根据尼罗罗非鱼IgT基因序列构建原核表达载体获得IgT重组蛋白，相对分子量约75 kDa，并制备出效价较高的小鼠抗罗非鱼IgT的多克隆抗体. 荧光定量PCR检测证明:健康尼罗罗非鱼中IgT在多种组织中都有表达，其中脾脏、皮肤、肠和鳃中表达量相对较高. 无乳链球菌感染后，皮肤和头肾中IgT mRNA的相对表达量分别在12 h和4 d显著上调. 免疫组化结果显示:IgT蛋白在头肾和皮肤中均有少量分布，在无乳链球菌刺激后，在皮肤中出现大量分布. 以上结果表明:IgT在尼罗罗非鱼皮肤粘膜免疫中具有重要作用.     

氯化锂对脂肪组织Wnt信号及PPARγ表达的影响

对肥胖小鼠腹腔注射剂量为100和200 mg/kg小鼠体质量的氯化锂水溶液,实验期间记录小鼠体质量,于注射3周后采用半定量PCR和Western blot方法检测小鼠腹股沟处内脏脂肪组织中,β-catenin和PPARγ的表达变化。结果表明:氯化锂处理后小鼠体质量增长速率略有下降,β-catenin的mRNA水平无明显改变(p>0.05),蛋白水平明显上升(p<0.05),PPARγ的mRNA和蛋白水平表达均下降(p<0.05)。提示氯化锂可能通过上调β-catenin蛋白水平,并抑制PPARγ表达影响小鼠早期肥胖发生。     

大鼠海马发育过程中CRMPs家族mRNA的表达

目的:探讨大鼠海马发育过程中坍塌反应调节蛋白(CRMPs)家族mRNA的表达规律.方法:用RT-PCR方法检测大鼠发育不同阶段CRMPs家族mRNA的表达.结果:RT-PCR实际扩增长度与设计长度相吻合.内参照β-actin电泳条带在发育各时期灰度无明显差异.CRMP-1 mRNA以新生鼠和幼年鼠表达最多,成年大鼠弱表达(P<0.05).CRMP-2从胚胎鼠至幼年鼠呈现逐渐增加的趋势,成年鼠相对较低(P<0.05).CRMP-3以幼鼠和成年大鼠表达较多,其中幼鼠表达最多(P<0.05),新生鼠表达最少(P<0.05).CRMP-4在胎鼠、新生鼠和幼年鼠表达量接近,成年鼠表达相对较低(P<0.05).CRMP-5在各个阶段均呈较高表达,以新生鼠和成年鼠表达较多,其中成年大鼠表达最多(P<0.05),胎鼠表达最弱(P<0.05).结论:从胚胎期至幼年期,CRMPs家族除CRMP-4稳定于高表达水平外,其余成员表达量均逐渐增多,其中CRMP-3和CRMP-5区别于其他成员,在成年期表达量继续增高.     

HAC1基因过表达对重组人CTLA-4蛋白在毕赤酵母中分泌表达的影响

重组人细胞毒性T细胞相关抗原(Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen 4,CTLA-4)是一类重要的基因工程药物,其在毕赤酵母中表达水平偏低使其一直无法广泛应用于临床治疗.而影响毕赤酵母中的外源蛋白分泌表达的因素,主要为内质网中的折叠速率以及不可折叠蛋白积累造成的胞内胁迫压力.本文通过在毕赤酵母细胞中过表达HAC1基因对毕赤酵母细胞中未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)的信号通路进行调控,从而改善了CTLA-4蛋白的表达水平.摇瓶中改造菌株M-HAC1发酵上清液中该蛋白的分泌表达量是原始菌株表达量的2.55倍.     

小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定

构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具。利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成法合成小鼠Sirt3基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建慢病毒表达质粒。进行酶切及测序验证后,将慢病毒表达质粒连同辅助包装原件载体质粒共同转染入293T细胞,收集上清,测定病毒滴度。用Sirt3基因过表达慢病毒感染SK-N-SH细胞,即为Sirt3过表达组(Sirt3);用空载体慢病毒感染的SK-N-SH细胞为空载体组(GFP);未感染病毒的SK-N-SH细胞为对照组(CON)。收集细胞后,用Real-time PCR法检测各组细胞Sirt3 mRNA的水平;用Western blotting法检测各组细胞Sirt3蛋白的表达。Sirt3基因过表达慢病毒载体构建成功,病毒滴度为1.0×10~9TU/m L。Sirt3组SK-N-SH细胞的Sirt3 mRNA和Sirt3蛋白水平均显著高于GFP组和CON组(P0.01)。成功构建的Sirt3基因过表达慢病毒载体具备高效感染力,能在SK-N-SH细胞高效过表达Sirt3,本研究结果为今后进一步在神经细胞和模型动物中研究Sirt3的作用提供了新的途径和工具。     

GADD45β过表达抑制膀胱癌细胞T24的增殖

GADD45β(growth arrest and DNA damage,GADD)在肿瘤的发生、发展以及凋亡过程中起着重要作用。首先利用Real-time quantitative(qPCR)检测到32μg/mL巴西苏木素处理人类移行膀胱癌T24细胞6h后,GADD45β的mRNA水平显著上调2.7倍。为了研究GADD45β在巴西苏木素致死T24细胞中的作用,从T24细胞的cDNA中扩增获得GADD45β基因全长读码框,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1上,构成重组载体pcDNA3.1-GADD45β。将该真核表达载体转染T24细胞,发现GADD45β在mRNA水平的表达显著上调,表明真核表达载体成功转入T24细胞;观察GADD45β过表达后对肿瘤细胞的影响,发现细胞变圆,贴壁性变差,活性显著降低85%。本研究表明GADD45β在T24细胞中的过表达能有效地抑制细胞生长,对细胞有较强的致死作用。     

α-Synuclein蛋白过表达对小鼠纹状体的影响

 帕金森病是世界第二大老年神经退行性疾病,致病机理极为复杂。α-synuclein（α-syn）是帕金森病主要病理特征的路易小体的主要组成成分,其突变基因α-syn A30P 也与部分家族性帕金森相关。通过对过表达野生型人源α-syn WT 及其突变体α-syn A30P 蛋白的转基因小鼠的行为学检验、脑部纹状体中氧化应激水平以及儿茶酚胺异喹啉物质水平的检测,研究过表达α-syn 蛋白对小鼠纹状体产生的影响。结果显示转基因小鼠模型与正常鼠相比,其协调能力明显下降,纹状体与全脑的比例显著降低。同时,模型鼠脑中的氧化应激水平与儿茶酚胺异喹啉物质的表达水平均显著升高。研究结果说明,α-syn 蛋白及其突变体的过表达会引起小鼠脑部纹状体中氧化应激水平与儿茶酚异喹啉物质表达水平的升高,从而导致纹状体组织严重损伤。     

人凝血Ⅸ因子乳腺特异性表达载体在离体细胞和小鼠乳腺组织中表达的初步研究

以小鼠MAR（matrixattachmentregion）元件,牛β－酪蛋白（β－casein）基因5＇端2．0kb调控顺序,人凝血Ⅸ因子小基因（hFIXminigene）构建乳腺组织特异性表达载体,表达载体和质粒pSV－neo共转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,兔皮肤纤维细胞（RSF）和人胚肾上皮细胞（293细胞）．发现hFIX基因在CHO细胞中获得低水平表达,最高表达量为7．2ng／ml．在皮肤成纤维细胞中的表达量低于2ng／ml．在293细胞中没有表达．表达载体用stearylamine（SA）脂质体包埋后尾静脉注射哺乳期小鼠,hFIX蛋白在小鼠乳汁中表达水平高达87．34ng／ml．     

MicroRNA-122过表达转基因小鼠的建立

目的:建立microRNA-122 (mir-122)过表达转基因小鼠模型,为今后研究肝脏发育,分化及肝癌预防、诊断及治疗等提供实验模型.方法:构建mir-122过表达载体,利用受精卵前核显微注射法将mir-122过表达载体导入小鼠受精卵中,获得mir-122过表达转基因小鼠.PCR法检测转基因小鼠的整合情况,实时定量PCR法检测mir-122过表达转基因小鼠肝脏及其主要器官mir-122及其确定靶基因高亲和性阳离子氨基酸转运体-1(CAT-1),切割同源物1(CUTL-1),血清反应因子(SRF)的表达情况.结果:mir-122过表达转基因小鼠,与同窝阴性鼠相比,mir-122在过表达转基因小鼠肝脏及主要器官中的表达升高,mir-122靶基因表达水平下降.结论:成功构建mir-122过表达转基因小鼠.     

小白菊内酯对RAW264.7炎症细胞因子表达的抑制

目的:研究小白菊内酯对细菌脂多糖诱导炎症反应的抑制作用.方法:选用小鼠巨噬细胞RAW264.7,采用实时定量多聚酶链式反应及酶联免疫吸附法,检测不同浓度小白菊内酯(0.1、1、10、50μmol/L)和细菌脂多糖(10μmol/L)作用后,细胞因子的mRNA(IL-6、TNF-α、Ptgs2、IL-1β、IL-10、MMP13与CXCL1)及蛋白(IL-6、TNF-α、IL-1β与IL-10)表达水平的改变.实验同时设立4个对照组,包括DMSO组、脂多糖组、DMSO+脂多糖组及阳性药Bay 11-7082+脂多糖组.结果:浓度分别为10和50μmol/L小白菊内酯稳定有效地抑制脂多糖诱导小鼠巨噬细胞产生细胞因子.在mRNA水平上,IL-6、TNF-α、Ptgs2、IL-1β、IL-10与MMP13的mRNA表达水平明显下降,差异有显著性,CXCL1 mRNA表达水平改变无统计学差异;在蛋白水平上,IL-6、TNF-α、IL-1β与IL-10的表达亦显著性下降,有统计学差异.结论:小白菊内酯有效抑制了细菌脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞中炎症细胞因子的表达.     

小鼠主要组织相容性复合体在鼠肝癌H_(22)中的表达

目的观察小鼠主要组织相容性复合体(H-2)在小鼠移植性肝癌的核酸及蛋白水平的表达,初步探讨动物移植性肿瘤的可移植机制。方法以小鼠移植性肿瘤H22为实验材料,BALB/c小鼠为荷瘤动物,以荷瘤小鼠肝脏为参照,应用RT-PCR技术检测H-2分子在mRNA水平的表达,以免疫组化技术检测在蛋白水平的表达。结果在小鼠移植性肝癌H22中,H-2分子在核酸水平的表达无异常,而在蛋白表达水平出现下调。结论鼠肝癌H22的H-2分子在蛋白水平的表达下调可能与肿瘤的可移植性有关。     

caveolin-1 siRNA对成釉细胞中CD147糖基化及MMP-2表达的影响

目的:研究caveolin-1的表达对小鼠成釉细胞CD147糖基化及MMP-2表达的影响.方法:首先利用细胞免疫荧光技术检测体外培养的小鼠成釉细胞中caveolin-1、CD147和MMP-2蛋白的表达;然后利用siRNA技术封闭小鼠成釉细胞中caveolin-1的表达,实时定量荧光PCR和免疫印迹试验分别检测caveolin-1、CD147和MMP-2在转录水平和蛋白水平的表达情况,并统计学分析.结果:caveolin-1、CD147和MMP-2蛋白表达于体外培养的小鼠成釉细胞中;caveolin-1siRNA转染成釉细胞后caveolin-1mRNA和MMP-2mRNA的表达量明显降低,但CD147mRNA的表达量没有明显变化;caveolin-1、高糖型CD147和MMP-2的蛋白表达量均降低.结论:caveolin-1、CD147和MMP-2表达于小鼠成釉细胞中,提示3者参与成釉细胞生物学过程;在体外培养的成釉细胞中,封闭caveolin-1基因的表达可降低HG-CD147和MMP-2的表达.     

A549-KIF4A过表达细胞株的构建与鉴定

非小细胞肺癌A549细胞中驱动蛋白KIF4A的表达量极低.为研究KIF4A在肺癌发生和发展过程中的作用,利用脂质体转染的方法,将p EGFP-KIF4A质粒和p EGFP-C1质粒分别转入A549细胞中,用G418筛选得到单克隆,并扩增得到稳定表达GFP-KIF4A和GFP的细胞株.利用Western Blot以及免疫荧光染色法对得到的细胞株进行鉴定.结果表明:A549-GFP-KIF4A细胞中GFP-KIF4A蛋白的表达水平较高,A549-GFP-C1中仅表达GFP蛋白.免疫荧光检测表明:A549-GFP-KIF4A过表达细胞中GFP-KIF4A荧光融合蛋白的定位与内源KIF4A的定位相同.     

重组小鼠14-3-3蛋白theta亚型的构建

目的 克隆编码14-3-3蛋白质θ亚型的cDNA,制备该蛋白质的基因重组蛋白质.方法 参照小鼠14-3-3蛋白质θ亚型mRNA结构设计引物,以小鼠脑总RNA为模板,RT-PCR法克隆编码14-3-3蛋白质θ亚型的cDNA,插入原核表达质粒pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)使其表达谷胱甘肽S转移酶(GST)为标签的融合蛋白质,以凝血酶定点分解融合蛋白并采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化目的 蛋白.结果 RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离可见约800 bp条带,序列分析表明重组质粒pGEX-1433theta中的插入子为738 bp,编码245个氨基酸,其核苷酸及氨基酸序列与Pubmed NM-011739展示的结果一致.重组质粒pGEX-1433theta在BL21(DE3)中的表达量随IPTG诱导时间递增,融合蛋白质为可溶性组分.亲和层析纯化的14-3-3theta在SDS-PAGE上表现为单一条带,表观相对分子质量为30 ku.每L培养菌液可收获4mg基因重组型小鼠14-3-3theta.结论 克隆了编码小鼠14-3-3蛋白质θ亚型的cDNA,制备了高纯度基因重组型小鼠14-3-3theta,为进行单克隆抗体的制备奠定了坚实的基础.     

FTO过表达对小鼠胰岛β细胞功能的影响以及全基因组表达谱变化研究

为了研究肥胖基因FTO过表达对小鼠胰岛β细胞功能的影响以及基因表达谱的变化,构建小鼠FTO基因过表达慢病毒载体,包装慢病毒颗粒并感染小鼠胰岛MIN6细胞.利用QPCR和WesternBlot技术检测FTO基因在MIN6细胞中过表达情况,并检测葡萄糖刺激检测胰岛素的释放情况,进一步利用小鼠全基因芯片检测FTO过表达对小鼠胰岛MIN6细胞表达谱的影响.结果表明：慢病毒载体成功介导了FTO在MIN6细胞中过表达,FTO过表达可以显著抑制MIN6细胞的胰岛素释放.表达芯片的结果显示FTO改变MIN6细胞表达谱,发现多达922个的差异基因.FTO过表达改变了小鼠胰岛细胞的表达谱,差异基因通过一些重要信号通路影响小鼠胰岛β细胞的生物学功能.     

FSH受体抑制剂对卵巢发育及FSHR和ERβ表达水平研究

目的:研究卵泡雌激素(FSH)受体结合抑制剂(FRBI)对卵巢组织中FSH受体(FSHR)和雌激素受体β(ERβ)基因和蛋白表达水平的作用,并探究FRBI是否通过调控FSHR和ERβ的表达来抑制卵巢癌的发生.方法:将180只雌性小鼠随机分为对照组(CG)、FSH组和实验组.实验组又分为4个小组(n=30),分别注射不同浓度的FRBI(10 mg/kg至40 mg/kg),测定卵巢皮质厚度(OCT)、次级卵泡的最大横径(MTD)、FSHR mRNA的表达水平和血清雌二醇(E2)浓度.结果:FRBI可以减少OCT和卵泡数量.较高剂量的FRBI(30 mg/kg～40 mg/kg)可抑制卵巢和卵泡发育,降低卵巢内ERβ和FSHR mRNA蛋白的表达水平,并减少E2产生.结论:FRBI可下调卵巢组织FSHR和ERβ表达水平.     

在APAP、TAA诱导的肝细胞药物性损伤中C/EBPβ对FXR的调控机制

目的:通过生物信息学分析寻找对乙酰氨基酚(APAP)诱导药物性肝损伤(DILI)过程中的关键基因，并研究在APAP、硫代乙酰胺(TAA)介导的小鼠肝细胞药物性损伤中，CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)对法尼醇X受体(FXR)的调控机制。方法:采用生信分析筛选APAP诱导的DILI模型中的关键基因；通过RT-qPCR、Western blot法检测不同浓度的TAA(0、13、33 mmol/L)、APAP(0、2、5μmol/L)对小鼠肝细胞AML12中C/EBPβ及FXR的mRNA及蛋白水平表达的影响。针对C/EBPβ基因设计两条不同的shRNA,并分别克隆至pLKO载体，用于构建C/EBPβ稳定敲低的AML12细胞系；通过流式细胞术分析TAA、APAP对AML12细胞凋亡的影响。结果:(1) FXR是APAP所致DILI模型中的关键性基因；(2)TAA和APAP导致AML12小鼠肝细胞损伤中FXR的mRNA及蛋白表达水平均显著降低；(3)TAA和APAP导致AML12小鼠肝细胞损伤中C/EBPβ蛋白表达水平显著降低；(4)C/EBPβ稳定敲低的AML12细胞系中FXR的mR...     

饥饿状态下HNF4α对MTP的表达调控

肝细胞核因子4α(HNF4α)是肝脏中一种重要的转录因子,其参与多个代谢途径的调控.微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)是极低密度脂蛋白装配和分泌过程的限速酶.C57BL/6J小鼠中研究发现,饥饿可以诱导肝细胞MTP基因的表达.在HepG2细胞中进一步证实饥饿可以诱导MTP表达,同时HNF4α表达也显著上升.实验证实MTP是HNF4α的靶基因之一,用腺病毒介导的HNF4α过表达和HNF4α的激动剂均显著提高MTP的表达;HNF4α特异性siRNA抑制HNF4α的表达,MTP的mRNA和蛋白水平相应下调.结果证明,在饥饿状态下可以诱导MTP和HNF4α的表达,MTP的表达量上升是受到HNF4α的转录调控.