PGA在含环氧活性基的多孔高聚物载体上的固定化及修饰

研究了青霉素G酰化酶(PGA)在含环氧活性基的多孔高聚物载体上的固定化及修饰,优化固定化条件为1 mol/L,pH 8.0的磷酸钾缓冲体系,每克载体(湿重)投酶量为500~550 U,30℃下150 r/min固定化36~48 h,得到的固定化酶表观酶活为每克载体(湿重)177 U,表观酶活回收率35%。固定化酶经巯基乙醇修饰后提高了热稳定性。固定化酶水解青霉素G的最适pH为9.0,最适温度为47℃,在pH 4~9,40℃以下稳定。固定化酶的各项性能均优于游离酶。     

PEG修饰青霉素酰化酶及其在两水相生物转化体系中的分配

厅用对甲苯磺酰氯法,用聚乙二醇对青霉素酰化酶进行化学修饰,修饰酶的比活为未修饰酶的75％,稳定性比游离酶有了很大提高。酶在带修饰酶的聚乙二醇与葡聚糖组成的两水相体系中的分配系数为25。     

固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的制备

粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶通过共价结合在环氧型载体EupergitC上,通过对酶质量浓度、固定化反应时间、pH 值以及反应温度等条件的考察,确定了最优固定化条件：375mg比活力5000U/g的重组粪产碱杆菌青霉素G酰化酶蛋白对应1g载体,最适pH8.0,反应温度30 ℃.反应120h后制得固定化青霉素G酰化酶活力达到220U/g,固定化酶效率为10.7%.该固定化酶可在含饱和乙酸丁酯磷酸缓冲液中彻底水解青霉素G钾盐.经过15批连续水解反应,固定化酶仍保持95%的活力,展现出良好的稳定性.     

功能基化聚丙烯酸甲酯固定青霉素G酰化酶的性质

采用肽键法将青霉素G酰化酶固定在功能化的聚丙烯酸甲酯上得固定化酶 ,其最适pH为8.2,最适反应温度为70℃ ,该固定化酶在pH6～10和40℃以下非常稳定 ,表观米氏常数为1.48×10-2mol/L,最大反应速度为5.09mmol/s.33℃下水解质量分数为5 %的青霉素G,使用63次,酶活力保留79.4 %.在4℃的湿润状态下贮藏25d,酶活力保留97.6 %.     

大孔GAM珠状聚合物固定化青霉素酰化酶催化性能的研究

应用反相悬浮技术合成了大孔甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)-丙烯酰胺(AM)-N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)珠状三元聚合物GAM,并用于制备固定化青霉素酰化酶.在37℃时,用固定化酶PA/GAM(粒径0.10~0.13 mm)水解青霉素G制备6-氨基青霉烷酸(6-APA),其表观活性为569 IU/g,表观米氏常数k′m为1.7×10-2mol/L,最大反应速度vmax为6.1×10-4mol/min,水解反应最适温度为50℃,最适pH值为8.0.固定化酶在pH值为4.0~9.0,且温度低于40℃时活性稳定,经20次间歇操作使用后,催化活性没有明显衰减,有良好的应用前景.     

渗透休克法提取重组青霉素G酰化酶及酶学性质研究

为简化后期提取工艺,采用渗透休克法提取基因工程菌重组青霉素G酰化酶,回收率92.4%的酶蛋白释放到胞外,纯度达80%,比酶活26.4 U/m g.酶学性质研究表明,K cPGA的最适作用pH和温度分别为pH 7~9和50℃,在pH 5.0~8.0和低于40℃的范围较稳定.     

硅藻土强化吸附壳聚糖固定化青霉素酰化酶

文中针对壳聚糖颗粒机械强度不够和比表面积不大的缺点,用无机多孔材料硅藻土(celite)在低压下强化吸附壳聚糖,再用戊二醛使其活化,以此为载体通过共价结合固定化青霉素酰化酶。以酶活和回收率为指标,讨论了活化、固定化及酶反应的不同条件对固定化青霉素酰化酶的酶活和回收率的影响。当戊二醛溶液质量分数为5%、pH值为8.5;酶固定化温度为27℃,固定化pH值为7.6,固定化时间为12～18h时,为最佳固定化条件。固定化酶的酶活可达10000mol/s左右,回收率约为40%。固定化酶的储存稳定性和热稳定性好,载体有良好的强度。     

青霉素酰化酶研究——Ⅰ.抑制作用,纯化和性质

丙酮、乙醇和苯丙氨酸是大肠杆菌青霉素酰化酶的竞争性抑制剂,分别抑制模拟底物3-苯乙酰胺基6-硝基苯甲酸水解的活力。青霉素酰化酶粗酶液经硫酸铵盐析,pH5沉淀,SE-Sephadex C50层析,苯丙氨酸-Sepharose 4B疏水层析和DEAE-Sephadex A25层析可得纯酶,聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳呈现一条带,比活为27.5u/mg蛋白。纯化总活力回收率为28.1%。青霉素酰化酶分子量约为90000,有两个亚基,分子量分别为70000和20000,其最适温度为40℃,最适pH为8.0,催化青霉素G水解的米氏常数为2.94mmol/L。     

大肠杆菌108(pPAHD1)青霉素G酰化酶的纯化与结晶

大肠杆菌108(pPAHD1)发酵液经离心沉淀,蔗糖高渗处理得到青霉素酰化酶粗品,再经苯乙酰胺-Sepharose4B疏水层析和DEAE-Cellulose DE-52分离纯化,得到可用于结晶的青霉素G酰化酶。在55％饱和度硫酸铵-0.05mol/LPBS,pH7.5条件下批量静置得到该酶晶体。     

聚甲基丙烯酸缩水甘油酯固定化青霉素酰化酶性质的研究

应用反相悬浮技术合成了珠状甲基丙烯酸缩水甘油酯 - N ,N′-亚甲基双 (丙烯酰胺 )共聚物 ,并将巨大芽孢杆菌 ( Bacillus megaterium)青霉素酰化酶共价偶联到甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物载体上 ,制成固定化青霉素酰化酶 ,其表观活性为 3 71 U/g(干重 ) ,水解青霉素 G钾盐的最适温度为 47°C,最适 p H为 8.5 ,在 p H4.5～ 9.0 ,温度 40°C以下时酶的活性稳定 ,表观米氏常数 Km为 1 .3 3× 1 0 -2 mol/L ,最大反应速度 vmax为 1 .2 7× 1 0 -5mol/min,固定化酶在 4°C冰箱保存 3 5 d,再水解 w=0 .0 2的青霉素 G钾盐溶液 ,重复使用 3 0次 ,保留酶活性 88.1 %。     

离子液体提高青霉素G酰化酶催化活性作用机制研究进展

青霉素G酰化酶(penicillin G acylase, PGA)是生物催化合成青霉素类和头孢菌素类等β-内酰胺抗生素的重要工业用酶,在药物中间体的合成、手性化合物的拆分、多肽合成过程中基团的保护和去保护等领域有重要的应用.设计与选择PGA固定化适宜的载体和酶催化反应介质,是提高PGA的合成活性和稳定性的有效途径.综述离子液体在青霉素G酰化酶固定化过程中的溶剂化作用和对载体的修饰作用以及催化反应的介质效应,分析离子液体阴阳离子的结构特点和体积大小、溶剂微环境、水活度及亲疏水性等因素对PGA催化性能的影响;总结介质效应及离子液体功能化提高催化剂活性的作用机制,并对离子液体在酶催化技术的应用前景提出展望.     

青霉素G酰化酶在磁性复合载体上的固定化及其酶学性质

利用凝胶-溶胶方法对磁性Fe3O4微粒表面进行功能化修饰,制备了表面含氨丙基的磁性复合载体,并通过戊二醛交联制备固定化青霉素G酰化酶(PGA).结果表明,在37℃时,固定化酶水解青霉素G钾盐,制备6-氨基青霉烷酸的表观活性为1 886 IU/g,表观米氏常数K'm＝140 mmol/L,最大反应速度Vmax＝0.45 ...     

固定化青霉素酰化酶在光敏感可再生两水相体系中催化青霉素G为6-APA

在一种光敏感可再生高聚物(PNBC 300000)与葡聚糖20000(Dextran 20000)形成的两水相体系中进行固定化青霉素酰化酶的相转移催化青霉素G产生6-APA的反应。在这个两水相体系中,当pH为7.8,底物浓度为62 mmol/L,反应温度为20℃,在50 mmol/L KCl存在下,6-APA的分配系数可达8.4。催化动力学显示,达到平衡的时间近6 h,PG(Na)转化率约82.6%。3批半连续反应转化率为60%~70%,较相近条件下的单水相反应得率提高近20%。在两水相中,底物及产物主要分配在上相,固定化酶分配在下相,底物青霉素G进入下相经酶催化产生的6-APA及苯乙酸又转入上相,从而解除了青霉素酰化酶催化反应的底物及产物抑制作用,达到提高产物得率的效果。形成两水相的高聚物通过488 nm的激光照射可实现循环利用,高聚物的光照回收率在95%~98%。     

GMA-NVP-MBAA三元聚合物载体固定化青霉素酰化酶性能的研究

利用反相悬浮聚合技术合成了珠状甲基丙烯酸缩水甘油酯—N—乙烯砒咯烷酮—N，N’—亚甲基双丙烯酰(GMA—NVP—MBAA)三元GNM共聚物．研究表明，GMA与NVP质量比为1：10，MBAA为单体总量50％合成的GNM(50)固定青霉素酰化酶，固定化酶水解青霉素G钾盐活性达491U／g．固定化酶经4次使用后活性达到稳定值为444U／g，再经14次使用，活性几乎不变．同时，考察了水解反应温度、pH值对固定化酶活性的影响．     

用大孔吸附树脂固定化青霉素酰化酶的研究

用四种大孔吸附树脂制备固定化青霉素酰化酶。结果表明,AB—8型和0.01CC型树脂固定化酶活力回收较高,分别为14.2％和12.4％,其它两种型号的树脂固定化酶活力回收均小于10％。同时研究了温度、pH、戊二醛对AB—8型和0.01CC型树脂固定化酶活力的影响以及这两种固定化酶的操作稳定性。     

固定化酶催化合成头孢克洛与产物的分离纯化

应用来源于粪产碱杆菌的青霉素G酰化酶催化合成头孢克洛,并对生物转化反应过程进行了研究.在反应条件:pH 7.0、25℃、磷酸钠缓冲体系、加酶量3 U/mL和底物浓度60 mmol/L时,转化率达到85%,表明粪产碱杆菌青霉素G酰化酶具有较高的催化活力.研究了新型分离纯化方法,经过树脂分离的产物纯度超过95%,主要杂质含量小于0.5%,可以达到药典要求,为生物法合成头孢抗生素走向产业化奠定了基础.     

粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的分离纯化及酶学性质

采用DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Butyl-Sepharose CL 4B疏水层析,从重组大肠杆菌DH5a菌体中分离纯化得到粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA).经纯化,AfPGA纯度较粗酶提高50.6倍、比活达到212.7 U/mg,经HPLC测定纯度为92.8%,收率为78%.理化性质分析表明:AfPGA含有2个亚基(α亚基和β亚基,其Mw分别为2.90×104和5.92×104;AfP-GA等电点约为7.9～8.0,最适pH约为10.0,并在pH>7.0时表现出了稳定的催化活力.     

用渗透压冲击法提取青霉素酰化酶

采用渗透压冲击法提取青霉素酰化酶 ,粗酶液比活达8.20×10-8 mol/(s·mg) ,比超声波法高10倍以上 ,酶活总收率达93.3 %。     

黄原胶修饰糖化酶的性质研究

为更好地应用修饰糖化酶 ,对经黄原胶修饰的糖化酶基本性质进行了研究 ,结果表明修饰糖化酶的最适作用温度与对照酶基本相同 ,为65℃.但随着温度的升高修饰糖化酶对热的抗性增强 而修饰酶的 pH稳定范围有所变宽 ,对酸具有一定的抗性 修饰酶的米氏常数Km值变小 ,为0.788×10-2,而对照酶的Km值为1.17×10-2,表明修饰酶对底物的亲和力增强 在相同条件下 ,修饰酶催化反应的淀粉糖化DE值较高     

粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶拆分制备（S）-2-氨基-4-苯基丁氨酸

粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶（A lcaligenes faecalispenicillin G acylase,A-fPGA）可以对映选择性地水解N-苯乙酰苯基丁氨酸制备（S）-2-氨基-4-苯基丁氨酸。反应体系的pH及温度对酶的对映选择性影响不显著。研究表明,水饱和的乙酸乙酯体系要优于传统的水相体系,该体系显著提...