细胞凋亡——当前生命科学研究的热点课题

细胞凋亡是当前生命科学研究中最热门的领域之一,近几年的研究获得了许多重大突破。对凋亡中的热点问题,包括细胞接受胞内外信号的刺激启动凋亡、胞内凋亡特异性蛋白酶ｃａｓｐａｓｅｓ的活化、ｃａｓｐａｓｅｓ对细胞结构的降解、线粒体及Ｂｃｌ－２蛋白家族对凋亡的调控等方面的许多令人瞩目的进展做了介绍。此外,还专门介绍了非细胞体系对细胞凋亡研究的重要贡献及植物细胞凋亡的研究进展。     

Bid-BH3结构域短肽对线粒体PTP的作用及其机制

在细胞凋亡过程中,线粒体中通过释放促凋亡因子对细胞凋亡进行调控。而促凋亡因子的释放主要是由Bcl-2家族成员相互作用来调控的。Bcl-2家族成员在线粒体中的主要作用位点是内外膜接触点上的膜透过性转运孔（PTP）。应用体外方法来探讨促凋亡蛋白Bid的BH3结构域短肽对线粒体及其PTP的作用。实验发现促凋亡蛋白Bid的BH3结构域短肽能作用于线粒体PTP,引起线粒体肿胀、跨膜电位下降和细胞色素c释放;而突变的Bid-BH3结构域短肽因为不能与抑凋亡蛋白Bcl-xL结合而没有上述作用。此外,Bcl-xL和环胞菌素A（CsA)能抑制Bid-BH3短肽引起的线粒体膜通透性改变。以上结果说明,Bid-BH3短肽通过作用于线粒体PTP而使得线粒体膜通透性改变,可能通过Bid-BH3与Bcl-xL的结合并抑制Bcl-xL的抑凋亡进而实现促凋亡作用。对合成的Bid-BH3短肽促凋亡作用的研究,为将来研究细胞凋亡调控药物提供了基础。     

活性氧自由基和细胞凋亡

活性氧自由基可以引起衰老和一系列严重疾病,这已经被很多实验所证实,衰老的最终结果就是死亡,细胞死亡有两种:一是细胞坏死(necrosis),常常是细胞严重和突然受伤所产生的一种死亡形式,如缺血,高氧或物理的和化学的创伤,它属于细胞事故死亡,与衰老关系不大;另一种是细胞凋亡或细胞程序死亡(apoptosis,program celldeath),即受基因控制的死亡,也就是老死,细胞程序死亡的研究对延长寿命和肿瘤的治疗具有重要意义,哺乳动物的生存需要氧气,其细胞就存在于一个氧化环境中,它的存活需要一个适当的氧化和抗氧化的平衡,最近研究表明,很多诱导细胞凋亡的试剂都是氧化剂或细胞活化刺激剂,而很多细胞凋亡的抑制剂都是抗氧化剂或者是可以提高细胞抗氧化能力的试剂,最近—些研究提出,活性氧自由基可能就是细胞凋亡的介质或信号。     

JWA参与维甲酸、佛波酯和三氧化二砷诱导急性早幼粒细胞性白血病细胞分化和凋亡的可能机制

JWA基因是受维甲酸（RA）、13顺－维甲酸（13－cRA）和佛波酯（TPA）等调控的细胞骨架相关基因,以前的研究发现,JWA基因与细胞分化和凋亡有关,为了探讨JWA基因在急性早幼粒细胞性白血病（APL0细胞分化和凋亡过程中的作用及机制,分别用ATRA,4HPR,TPA和As2O3处理NB4细胞,Westernblot和RT0RCR检测JWA基因在蛋白和mRAN水平的表达,同时检测细胞周期和CD11b,CD33细胞表面抗原,分析细胞分化和凋亡,结果ATRA和As2O3分别诱导细胞分化和凋亡,而4HPR和TPA对NB4细胞分化和凋亡有双重诱导作用,在诱导细胞分化和凋亡过程中,JWA基因的表达水平均上调,但PML／RARα融合基因变化不明显,用JWA反应核酸处理NB4细胞后,TPA诱导其分化和凋亡的作用受到明显抑制,TPA对NB4的作用可能是通过由JWA参与的直接和间接两种途径实现的,在对APL（M3）原代细胞的研究中除观察到NB4细胞相似的JWA的变化外,还发现一特异的与APL细胞分化和凋亡有关的异常分子量的JWA蛋白;异常分子量的JWA蛋白是否是APL（M3）区别于NB4细胞的一种分子植物志以及JWA是否通过caspases信号调节通路参与NB4细胞分化和凋亡等均有待进一步研究证实。     

Bd-BH3结构域短肽对线粒体PTP的作用及其机制

在细胞凋亡过程中,线粒体通过释放促凋亡因子对细胞凋亡进行调控.而促凋亡因子的释放主要是由Bcl-2家族成员相互作用来调控的.Bcl-2家族成员在线粒体中的主要作用位点是内外膜接触点上的膜透过性转运孔(PTP).应用体外方法来探讨促凋亡蛋白Bid的BH3结构域短肽对线粒体及其PTP的作用.实验发现促凋亡蛋白Bid的BH3结构域短肽能作用于线粒体PTP,引起线粒体肿胀、跨膜电位下降和细胞色素c释放;而突变的Bid-BH3结构域短肽因为不能与抑凋亡蛋白Bcl-xL结合而没有上述作用.此外,Bcl-xL和环胞菌素A(CsA)能抑制Bid-BH3短肽引起的线粒体膜通透性改变.以上结果说明.Bid-BH3短肽通过作用于线粒体PTP而使得线粒体膜通透性改变,可能通过Bid-BH3与Bcl-xL的结合并抑制Bcl-xL的抑凋亡进而实现促凋亡作用,对合成的Bid-BH3短肽促凋亡作用的研究,为将来研究细胞凋亡调控药物提供了基础.     

JWA参与维甲酸、佛波酯和三氧化二砷诱导急性早幼

JWA基因是受维甲酸(RA)、 13顺-维甲酸(13-cRA)和佛波酯(TPA)等调控的细胞骨架相关基因. 以前的研究发现, JWA基因与细胞分化和凋亡有关. 为了探讨JWA基因在急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞分化和凋亡过程中的作用及机制, 分别用ATRA, 4HPR, TPA和As2O3处理NB4细胞, Western blot和RT-RCR检测JWA基因在蛋白和mRNA水平的表达, 同时检测细胞周期和CD11b, CD33细胞表面抗原, 分析细胞分化和凋亡. 结果表明ATRA和 As2O3分别诱导细胞分化和凋亡, 而4HPR和TPA对NB4细胞分化和凋亡有双重诱导作用. 在诱导细胞分化和凋亡过程中, JWA基因的表达水平均上调, 但PML / RARα 融合基因变化不明显; 用JWA反义核酸处理NB4细胞后, TPA诱导其分化和调亡的作用受到明显抑制. TPA对NB4的作用可能是通过由JWA参与的直接和间接两种途径实现的. 在对APL(M3)原代细胞的研究中除观察到与NB4细胞相似的JWA的变化外, 还发现一特异的与APL细胞分化和凋亡有关的异常分子量的JWA蛋白; 异常分子量的JWA蛋白是否是APL(M3)区别于NB4细胞的一种分子标志物以及JWA是否通过caspases信号调节通路参与NB4细胞分化和凋亡等均有待进一步研究证实.     

细胞色素c诱导胡萝卜细胞核的体外凋亡

在胡萝卜细胞胞浆提取物ＣＳ－１００中加入ＣｙｔＣ可建成高效诱导细胞凋亡的植物非细胞体系,在瞎术诱导体系中,温育的胡萝卜细胞核在表现典型的凋亡形态学特征的同时,其ＤＮＡ发生特异缓解形成ＤＮＡＬａｄｄｅｒ,ＴＵＮＥＬ实验也说明ＤＮＡ发生了３′－ＯＨ特异断裂,研究表明,ＣＳ－１００非细胞体系是研究植物细胞凋亡机理的一个很好的,方便在实验模式,在植物细胞凋亡过程中可能存在与动物细胞凋亡相似的机制。     

新型铂配合物Mor-platin导致细胞凋亡及抑制细胞迁移

探讨了新型铂配合物Mor-platin对人肺癌细胞(H1975)的抗癌效果以及对细胞迁移和侵袭的影响.运用噻唑蓝法和活性氧检测试剂盒,比较Mor-platin与经典抗癌药物顺铂影响H1975细胞存活率和活性氧产生的不同;利用细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒,研究Mor-platin和顺铂对细胞凋亡与细胞周期的影响;Western blot法检测Mor-platin对caspase相关蛋白caspase 3/8/9/脱氧核糖核酸修复酶(PARP)蛋白水平和凋亡相关蛋白B-淋巴瘤-2基因相关蛋白(Bax)/B-淋巴瘤-2基因(Bcl-2)比值的改变;最后使用划痕实验和transwell装置研究Mor-platin和顺铂对H1975细胞迁移和侵袭的影响.实验结果显示,Mor-platin与顺铂相比,在更低的浓度下即能杀死H1975细胞.另外,Mor-platin比顺铂更易产生细胞内活性氧,使细胞阻滞于S期,激活caspase相关蛋白caspase 3/8/9/PARP,增加Bax/Bcl-2比值,最终导致细胞凋亡.通过划痕与transwell实验还发现,Mor-platin可以抑制肿瘤细胞迁移和侵袭,而顺铂没有这种现象.综上所述,Mor-platin具有更好的抗肺癌细胞能力,以及独特的抑制细胞迁移能力,为铂类化合物的开发和肿瘤药物的研究提供了新思路.     

电离辐射诱发小鼠骨髓细胞依赖和不依赖P53基因的凋亡

细胞凋亡(apoptosis)或程序性细胞死亡(programmed cell death),是一种具有典型形态学和生化特征的细胞死亡模式。在胚胎发育,T,B细胞成熟和内分泌相关的组织萎缩等生命过程中发生的细胞死亡,就是一种生理性细胞凋亡,以此控制体内细胞数量。辐射和某些抗肿瘤药物等DNA损伤因子,亦能诱发细胞凋亡,并与某些肿瘤相关基因的诱导表达和蛋白稳定性的改变等事件发生相关。P53基因是一种抑癌基因,参与细胞增殖调控,使细胞生长停滞于G_1期。近年发现,P53基因在细胞DNA受损伤后引发的细胞凋亡过程中也起重要作用。不同学者分别报道,电离辐射诱发小鼠胸腺细胞和小肠上皮细胞的凋亡,是依赖于P53基因,包括P53基因表达增加和P53蛋白稳定性增强。在P53基因缺失纯合子小鼠中,电离辐射就不能有效地启动上述组织细胞的凋亡机制。本文利用基因打靶技术产生的P53基因突变小鼠模型,研究不同P53基因状态下,即野生型(P53+/+)、杂合子(P53+/-)和纯合子突变型(P53-/-),电离辐射诱发小鼠骨髓细胞的凋亡。     

丁酸钠诱导HeLa细胞凋亡过程中端粒酶活性及端粒长度的变化

研究了丁酸钠诱导的ＨｅＬａ细胞凋亡过程中端粒酶活性和端粒长度的变化。丁酸钠处理４８ｈ后,ＨｅＬａ细胞表现出明显的凋亡特征：染色质凝集,形成凋亡小体,ＤＮＡ在核小体间断裂并降解产生梯状电泳图谱。凋亡细胞中端粒酶活性无显著改变,端粒长度却急剧缩短;抑制端粒酶活性后,细胞对凋亡刺激的易感性增强,端粒的降解加快。以上结果表明,丁酸钠诱导的细胞凋亡与端粒长度密切相关,但不影响端粒酶的活性。端粒酶则可以通过保     

爪蟾卵非细胞体系诱导小鼠肝细胞核凋亡

通过向正常爪蟾卵提取物S_150中加入dATP和细胞色素c,得到能有效诱导外源细胞核凋亡的非细胞体系 .温育在上述非细胞体系中的小鼠肝细胞核表现出明显的凋亡特征并形成大量的凋亡小体 .染色质在核膜下凝集形成直径相差较大并相互分离的球形区域 ,球形小体通过核膜向外突出 ,并逐渐与核膜分离 .最后 ,细胞核几乎将所有DNA凝集并排出 ,只在核膜边缘残留一些DNA成分 ,而温育体系中充满高度凝集的凋亡小体 .这种凋亡小体产生的过程以往工作未见描述 .同时 ,小鼠肝细胞核在卵提取物中发生的形态变化伴随着染色质DNA被降解成DNAladder.我们的研究表明 ,利用爪蟾卵提取物研究细胞核凋亡是一个很好的实验模式 .     

p14ARF高表达对γ射线诱导的人黑色素瘤细胞凋亡的影响

抑癌因子ARF可以激活p53诱导细胞周期的阻断或凋亡. 为阐明ARF在促进细胞凋亡作用中的分子机理, 建立了高表达p14^ARF的人黑色素瘤A375细胞模型. 实验表明, p14^ARF高表达能促进p53富集在细胞核. 经 γ 射线照射后，发现p14^ARF高表达能促进A375细胞凋亡, 促使Smac从线粒体释放到胞质中, p53, Bax, Caspase-3, Caspase-9, p21^cip1和p27^kip1蛋白水平明显提高, 而Bcl-2和磷酸化的ERK蛋白水平下降. 提示γ 射线辐照下, p14^ARF促进A375细胞凋亡是ERK介入的依赖p53的以线粒体为核心的凋亡途径.     

重组可溶性TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡

在大肠杆菌系统中表达并纯化了3种不同长度的可溶性TRAIL,分别为sTRAIL（74－281）,sTRAIL(95－281）及sTRAIL(101－28）。细胞凋亡实验表明氨基酸101位前的序列对TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的生物学功能具有抑制作用。sTRAIL（101－281）能在6h内诱导不同类型的肿瘤细胞凋亡,但对正常细胞无毒性。不同类型的肿瘤细胞对TRAIL的敏感程度不同,一些敏感肿瘤细胞系中部分细胞对TRAIL具有抗性。根据实验结果提出抗性细胞中可能表达一种或多种半衰期短的、能抑制肿瘤细胞凋亡的蛋白的假说,并为探索将TRAIL开发成肿瘤治疗药物的可能性奠定了基础。     

植物-病原物互作中的细胞程序化死亡(PCD)

生物整体的死亡是司空见惯的现象。多细胞生物的细胞也存在着死亡现象,细胞的死亡可以分为两种形式:一种是坏死性或意外性死亡(Necrosis或Accidental death),它一般是物理、化学损伤的结果,即细胞受到外界刺激,被动结束生命;另一种死亡方式称为程序化死亡(Programmed cell death,PCD),这是一种主动的、为了生物的自身发育及抵抗不良环境的需要而按照一定的程序结束细胞生命的过程。因此,PCD是生命活动不可缺少的组成部分。在PCD发生过程中,一般伴随有特定的形态、生化特征出现,此类细胞死亡被称为凋亡(Apoptosis)。当然,也有的细胞在PCD过程中并不表现凋亡的特征,这一类PCD被称为非凋亡的程序化细胞死亡(Non-apoptotic programmed celldeath)。     

卵泡生长、分化和闭锁的调控

研究卵泡生长启动和分化对于了解雌性生殖机制至关重要. 哺乳动物卵细胞在胚胎发育过程中已经形成, 并且在生殖嵴每个卵原细胞都与若干原始卵泡细胞组合分化成一个原始卵泡. 出生后原始卵泡数不再增加. 原始卵泡生长启动的分子机制至今还不清楚. 相关研究的最新进展表明: (ⅰ) 原始卵泡的生长启动可能主要受卵泡内外产生的生长因子、激活素和孤儿受体等调节, 而可能不受FSH调节; (ⅱ) 在颗粒细胞上一旦分化出现FSH受体, FSH即与雌激素以及激活素/抑制素、卵泡抑素一起成为决定卵泡分化倾向的主要因素; (ⅲ) 卵泡闭锁可起始于颗粒细胞或卵母细胞凋亡两种形式, 卵母细胞中组织型纤溶酶激活因子(tPA)蛋白活性的提前表达将引发卵母细胞凋亡.     

爪蟾卵提取物中凋亡特异核酸酶抑制物的鉴定

细胞色素c加至非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵提取物S－150中,能诱导外源细胞核发生凋亡。诱导过程中,爪蟾凋亡特异核酸酶XAD被激活,在核小体间切割染色质,形成DNA梯（ladder).实验表明,正常卵提取物中大量存在凋亡特异核酸酶XAD抑制因子IXAD,抑制XAD的核酸酶活性;IXAD分子量约40ku,正常状态下以二聚体形成或与XAD形成复合体存在;凋亡中IXAD被降解,导致XAD被释放激活。Western检测和交叉抑制实验显示IXAD与DFF45在结构与功能上可能同源。实验结果进一步证明凋亡途径在进化上的保守性。     

HSV-1的microRNA-LAT基因修饰人骨髓间充质干细胞的体外研究

人骨髓间充质干细胞(HMSCs)具有强大的多向分化潜能, 能为组织移植和体外基因传递载体. 单纯疱疹病毒1型(HSV-1)不仅具有嗜神经元性, 而且对HMSCs也具有很强亲嗜性, 可作为HMSCs的基因修饰载体, 主要通过其自身携带的microRNA-LAT发挥抑制凋亡作用. 本研究构建针对microRNA-LAT的特异性茎环结构的逆转录引物, 并用特殊探针的real-time RT-PCR方法检测HMSCs细胞质中成熟microRNA-LAT的相对定量水平. 采用顺铂诱导对照法观察HSV-1对HMSCs的作用. 通过观察HMSCs细胞形态和流式细胞仪检测细胞凋亡率, 评测HSV-1引起的HMSCs抗凋亡功能; 同时采用RNAi方法, 化学合成TGF-β信号传导通路中SMAD3及TGF-β1靶点的siRNA和microRNA- LAT siRNA. 从基因mRNA, microRNA和蛋白质水平, 分别采用RT-PCR, real-time RT-PCR和Western blotting方法, 检测HMSCs中microRNA-LAT和SMAD3及TGF-β1表达水平及其相互关系. 结果表明, 与单纯顺铂诱导对照组相比, HSV-1组和microRNA- LAT组HMSCs凋亡细胞数减少, 细胞凋亡率降低(P < 0.05), 具有抗凋亡作用; 在TGF-β信号传导通路中, HSV-1组和microRNA-LAT组TGF-β1与 SMAD3靶点基因在mRNA水平及蛋白水平的表达量均观察到一定程度降低, 且降低水平与采用RNAi法的SMAD3组和TGF-β1组相类似. Real-time RT-PCR结果显示, 与空白对照组相比, 顺铂组HMSCs细胞质中成熟microRNA-LAT mRNA水平有所降低(P < 0.05). 据此, HSV-1 及其microRNA-LAT可敲除SMAD3和TGF-β1基因, 下调TGF-β信号传导通路表达而对顺铂诱导的HMSCs凋亡有拮抗作用. 本研究结果证明, HSV-1自身携带的microRNA-LAT对HMSCs细胞TGF-β信号传导通路中的SMAD3和TGF-β1具有精细调节和基因修饰作用, 使HMSCs具有抗凋亡功能, 并且HSV-1可作为针对HMSCs的特殊基因修饰候选载体.     

杆状病毒诱导凋亡昆虫细胞中的线粒体反应和Ca2+的变化

以罗丹明123作为线粒体跨膜电位荧光标记探针, 流式细胞术和激光共聚焦显微镜研究显示, SfaMNPV诱导凋亡的斜纹夜蛾SL-1细胞, 线粒体跨膜电位(&#8710;Ψm)产生明显改变, 病毒接种后4 h, 膜电位开始下降, 随着病毒感染进程的延续, 线粒体膜电位&#8710;Ψm持续降低. 利用Western 杂交分析定位于线粒体的Bcl-2蛋白, 结果表明, 线粒体Bcl-2蛋白含量随病毒感染逐渐减小, 表达水平降低, 病毒感染下调了Bcl-2蛋白的表达. Western杂交检测到显示细胞色素c从线粒体向细胞质中释放, 并在细胞质逐渐积累, 呈时间依赖性特征. 病毒感染诱发的线粒体反应, 提示杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡, 可能存在线粒体介导的凋亡信号转导途径. 以Ca²⁺荧光探针Fluo-3/AM负载, 激光共聚焦显微镜观察和荧光分光光度计测定凋亡细胞 [Ca²⁺]_i浓度的变化, 检测到病毒诱导凋亡细胞内的[Ca²⁺]_i浓度明显升高, 细胞外Ca²⁺内流; 在EGTA抑制胞外钙离子内流和细胞质Ca²⁺钳制状态下, PI染色后流式细胞仪检测显示细胞凋亡不受影响, 说明胞质内游离Ca²⁺升高和胞外钙离子内流不是细胞凋亡的主要诱因, 提示内质网钙库Ca²⁺排空可能是SfaMNPV诱导SL-1细胞凋亡信号转导通路中的重要媒介.     

新基因bak研究进展简评

ｂａｋ是ｂｃｌ－２基因家族中的促凋亡成员,同时也是一个重要的细胞凋亡诱发基因。Ｂａｋ通过其ＢＨ３结构域与凋亡抑制因子相互作用从而拮抗其凋亡抑制活性,加速细胞死亡。研究表明,许多疾病的发生与ｂａｋ基因表达异常有关;一些抗肿瘤药物的作用过程也伴随ｂａｋ基因表达的改变。     

一种新的植物细胞凋亡原位检测方法

介绍一种由动物细胞凋亡ＩＳＥＬ技术衍生的,并与原生质体染色体制片技术相结合的植物细胞凋亡原位检测方法,此方法简单,直观,灵敏度高,避免了假阳性和非特异性信号的出现;可同时从染色体,核以及ＤＮＡ不同层次对植物细胞凋亡的的特征进行原位检测,并可观察它们在凋亡过程中各个时期的特征及动态变化。用此方法检测了盐胁迫诱导的玉米根尖细胞凋良,结果表明盐胁迫下的植物细胞确实具有动物细胞凋亡的典型特征。