卵形鲳鲹MHC Ⅱα及MHC Ⅱβ组织特异性表达分析

为了从蛋白水平和mRNA水平上比较和分析MHC Ⅱα和MHC Ⅱβ基因在卵形鲳鲹不同组织中的表达情况,本研究构建了重组载体p ET32a(+)/M-Ⅱα和p ET32a(+)/M-Ⅱβ来诱导其表达,并制备了多克隆抗体,而且通过qRT-PCR技术分析了MHC Ⅱ类基因在卵形鲳鲹正常组织中的表达.结果显示,本研究成功表达了卵形鲳鲹MHC Ⅱα和MHC Ⅱβ基因的融合蛋白,并制备出了效价高和特异性强的多克隆抗体;在利用Western Blot技术分析MHC Ⅱα或MHC Ⅱβ基因在卵形鲳鲹不同组织中对蛋白的表达情况时,均检测到一条大小约70k Da的疑似MHC Ⅱαβ二聚体的单一条带,且该MHC Ⅱαβ二聚体在脾脏、头肾、肠道、鳃中的表达量较高,而在胃、心、脑、肝中的表达量稍低.qRT-PCR的分析结果一致表明,MHC Ⅱ类基因广泛分布在不同组织中,尤其在与免疫相关的组织(脾脏、头肾、肠道、鳃)中,其具有较高表达量.     

大黄鱼Rab11基因的克隆与表达分析

克隆了大黄鱼小G蛋白家族中的Rab11基因,测序查明其cDNA序列全长1373 bp,其中5’非编码区为129 bp,3’非编码区为587 bp,开放阅读框为657 bp,编码218个氨基酸;其氨基酸序列与罗非鱼、斑马鱼等鱼类Rab11蛋白序列同源性在95％左右,与人类、大熊猫等物种的同源性也达到90%以上。Rab11基因在大黄鱼脾脏、鳃、肾脏、皮肤、肝脏、血液、肠、心脏和胃9个组织中均有表达,在血液、肝脏中表达量最高,在胃中表达量最低;溶藻弧菌刺激后大黄鱼肝脏、肾脏和脾脏组织中Rab11基因的表达量均明显上调,提示Rab11在大黄鱼的抗病免疫反应中有着重要的作用。     

尼罗罗非鱼主要组织相容性复合体Ⅱβ(MHCⅡβ)基因的克隆、表达和多态性

MHCⅡβ基因在鱼类免疫反应中起重要作用。采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)技术,克隆了尼罗罗非鱼的MHCⅡβ基因。MHCⅡβ基因含有5个外显子和4个内含子,其c DNA全长为1 142 bp,开放读码框为750 bp,编码249个氨基酸。通过同源性分析和进化树分析发现,与其他硬骨鱼类和哺乳类的相似性在30.6%~78.6%,和鲈形目的鱼类同源性最高。从25尾罗非鱼的50个开放读码框的阳性克隆中共获得10条不同的核苷酸序列,分别编码不同的氨基酸。氨基酸序列比对分析发现,多态性位点主要集中在MHCⅡβ基因的第2外显子上。通过对海豚链球菌感染后易感个体和抗病个体的PCR-SSCP电泳分析,发现电泳条带出现2~12条不同的单带,测序结果表明个体存在1~6个等位基因,暗示至少存在3个MHCⅡβ基因座。q PCR检测表明,MHCⅡβ基因在鳃、心脏、脾脏等组织高度表达,在肾脏、肌肉、脑等组织中中度表达,而在皮肤、肠、肝脏等组织中表达最弱。在攻毒后的头肾组织中,MHCⅡβ基因的表达量呈现下降-上升-下降的变化趋势,表明MHCⅡβ参与了罗非鱼的免疫反应。     

大黄鱼cyp19a/b基因的克隆与表达分析

克隆得到了调节雌雄激素平衡的大黄鱼cyp19a/b基因,cyp19a基因c DNA全长1805 bp(NCBI登录号:FJ800566),其中开放阅读框1557 bp,编码518个氨基酸;cyp19b基因c DNA全长2268 bp(NCBI登录号:FJ800567),其中开放阅读框1503 bp,编码500个氨基酸.荧光定量PCR分析显示cyp19a基因在性腺中有明显的表达,且在卵巢中的表达量极显著且高于精巢;在肌肉、脑、肝脏、肾脏、脾脏等组织器官中基本不表达.而cyp19b基因在脑、脾脏和肝脏中有较高表达,在性腺和其他器官中基本不表达.     

牙鲆IDH-1基因型与溶菌酶活性的相关性研究

采用同工酶水平切片淀粉凝胶电泳及4种组织器官(肝脏、头肾、脾脏、中肾)及黏液溶茵酶琼脂板扩散活性测定法,分析了人工养殖牙鲆IDH-1(IDH基因座位1)基因型与溶菌酶活性的关系.研究表明,牙鲆体表黏液的溶菌酶活性与IDH-1基因型存在很强的相关性,杂合个体的溶菌酶活性显著高于纯合个体,差异极显著(P<0.05).     

藏猪NRAMP1基因的定量表达研究

采用半定量和定量PCR方法对藏猪的NRAMP1基因在脾脏等10个组织中的表达进行了研究.结果显示,该基因在所研究藏猪的组织中均得以表达,无组织表达特异性;定量PCR的结果证实该基因在不同组织中的表达量有很大的差异,其中,在脾脏中表达量最高,在肝脏中表达量最低,两者之间相差77倍,10个组织的平均表达量为3233拷贝/μg cDNA;NRAMP1基因在10个组织表达丰度从高到低的顺序为：脾脏、大脑、肺脏、回肠、肾脏、颌下淋巴结、结肠、心脏、肌肉和肝脏.     

日本鳗鲡不同组织器官的抗菌活性比较

用体积分数为10%的醋酸提取日本鳗鲡肝脏、鳃、脾脏、胆汁、肾脏和血清中的抗菌活性物质,检测其对养殖鳗鲡常见的4种致病菌,即肠杆菌Enterobacter sp.(B01)、迟缓爱德华氏菌Edwardsiellatarda(B09)、气单胞菌属Aeromona sp.(B18)和嗜水气单胞菌Aeromona hydrophila(B27)的抑杀作用.结果显示:1)肝脏、脾脏、胆汁和鳃的样品对4株试验菌株均有明显的抑菌作用,肾脏的对B18、B27和B013株致病菌有抑菌作用,血清的仅对B18有抑菌作用.2)不同样品对同一种致病菌的抗菌活性差异显著(P0.05),按平均抑菌圈半径计算,其抗菌活性大体呈现为:肝脏鳃脾脏胆汁肾脏血清;同一样品对不同细菌的抑杀作用差异显著(P0.05).采用反相高效液相色谱法分析上述各组织/器官的醋酸提取物中的活性组分,结果显示:肝脏、脾脏、胆汁和鳃样品中的活性组分(以杀伤指数大于50%计)主要集中于乙腈洗脱质量分数为19.4%～35.4%时,肾脏和血清中没有明显的抗菌作用(杀伤指数小于50%).     

饥饿再投喂对鳜肌FSRP-1、FSRP-3和肠道PepT1基因表达的影响

为探讨饥饿再投喂对鳜肌FSRP-1、FSRP-3和肠道中PepT1基因表达的影响,本研究采用qRT-PCR技术,测定饥饿7d再饱食一餐后0、1、3、6、12、24、48、96h条件下鳜肌中FSRP-1、FSRP-3和肠道中PepT1基因表达水平的变化,研究结果表明:FSRP-1基因表达在投喂后12h内显著升高(P0.05),12-48h维持在较高表达水平,48h后显著降低(P0.05);FSRP-3基因表达在投喂后1h内显著降低(P0.05),12h达到峰值且表达量是1h的5倍,48h后显著降低(P0.05);PepT1基因表达在投喂后6h内显著降低(P0.05),48h时表达量最高。FSRP-1、FSRP-3和PepT1是与鱼类生长相关的重要基因,受饥饿再投喂的影响较大。     

日本鳗鲡COX-2基因的克隆、鉴定及表达分析

应用PCR及RACE技术从日本鳗鲡(Anguilla japonica)中克隆获得一个2463 bp环氧化酶基因(Cyclooxygenase-2,AjCOX-2)的cDNA序列.AjCOX-2前体为606肽,含有脊椎动物COX-2的保守结构域,以及加氧酶和过氧化物酶的活性位点.在正常生理条件下,AjCOX-2基因在日本鳗鲡的鳃、鳔和皮肤中高水平转录表达.脂多糖刺激后8 h,AjCOX-2基因在皮肤和鳔中的转录表达显著上调(P0.05);多聚胞苷酸刺激后8 h,AjCOX-2在皮肤、鳔和鳃中的转录表达显著上调(P0.05);迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)刺激后8 h,AjCOX-2在鳔中的转录表达也极显著上调(P0.01).结果表明,AjCOX-2基因是对外来病原刺激的早期响应基因,参与机体抵抗外来刺激物的先天免疫应答.     

人溶菌酶基因密码子优化及其在小鼠乳腺中的表达

人溶菌酶是人体内的一种非特异性免疫物质,具有杀菌消炎、免疫调节、改善胃肠道菌群等作用,在抗生素替代方面具有广阔的应用前景。已报道人溶菌酶基因c DNA在内源的αS2酪蛋白基因启动子调控下的表达量不高(23~31μg/m L),特尝试密码子优化策略以改善表达量。优化了人溶菌酶基因c DNA的密码子,连入以小鼠乳清酸蛋白(m WAP)基因座序列为调控元件的乳腺表达载体,验证其表达效率。通过原核注射制备转基因小鼠,PCR检测发现,出生的21只小鼠中有4只为转基因阳性,且能按孟德尔遗传规律传递给下一代;Western blot检测表明,小鼠乳汁中有微量的重组人溶菌酶表达。因此,密码子优化后的人溶菌酶基因可以在小鼠乳腺中获得有效表达,这可为外源基因定点整合的人溶菌酶转基因动物的高效表达研究奠定基础。     

长链非编码RNA H19、Neat1、Meg3、Gas5在梅山与杜洛克猪卵泡及各组织中的差异表达分析

为探讨lnc RNA在卵泡及组织中的表达规律,采用荧光定量RT-PCR检测lncRNA H19、Neat1、Meg3、Gas5基因在杜洛克与梅山猪各级卵泡和猪不同组织中的表达量变化。结果表明:H19基因在杜洛克猪各级卵泡S、M1、M2、L中的表达量分别是梅山猪的3.61、0.57、4.19、3.27倍,各级卵泡品种间差异极显著(P0.01);Neat1基因在杜洛克猪各级卵泡中的表达量分别是梅山猪的3.94、1.16、1.63、1.44倍,其中S卵泡品种间差异极显著(P0.01);Meg3基因在杜洛克猪各级卵泡中的表达量分别是梅山猪的2.78、1.12、10.65、1.41倍,S、M2卵泡品种间差异极显著(P0.01);Gas5基因在杜洛克猪各级卵泡中的表达量分别是梅山猪的4.53、1.40、6.31、1.14倍,S、M2卵泡品种间差异极显著(P0.01),M1卵泡中差异显著(P0.05)。组织表达分析结果表明,各基因在下丘脑、垂体、子宫、卵巢等组织中均有表达。此研究表明,4个lnc RNA基因在杜洛克和梅山猪中表达量存在较大差异,可能影响卵泡的增殖、发育和成熟。     

大黄鱼免疫球蛋白M重链基因全长cDNA序列的克隆与表达

从本实验室自建的大黄鱼表达标签数据库中获取了大黄鱼免疫球蛋白M重链(LcIgMH)基因片段,并以此设计SMART-RACE引物,最终得到1917 bp的全长c DNA序列。经分析发现其含6 bp的5'非编码区(5'UTR)、176 bp的3'UTR以及1738 bp的开放阅读框(ORF);预测的ORF共编码584个氨基酸,蛋白质分子量为65. 2 ku,等电点为5. 84;利用Singal P 4. 1 Server发现其5'端含有信号肽(1-19 aa);Blast P Server的结果显示,其与红笛鲷的IgMH序列一致性最高,达到64%;利用IMGT/Domain Gap Align进行重链可变区与恒定区预测,发现含有1个重链可变区与4个重链恒定区,同时,预测还发现可变区含有典型的3个高变区与4个骨架区结构。实时荧光定量PCR结果显示该基因在头肾与脾脏中大量表达,并显著高于其他各组织,同时雌雄鱼LcIgMH在各组织中表达量均无显著性差异,表明LcIgMH表达与性别无关。注射副溶血弧菌进行感染4 d后,脾脏内LcIgMH表达量最高,并且与对照组之间存在显著性差异(P 0. 05),但感染后第8天的表达水平已与对照组无显著性差异(P 0. 05),显示LcIgMH与大黄鱼的免疫应答反应相关。     

棘腹蛙白细胞介素-34基因的克隆与组织表达分析

【目的】考察棘 腹 蛙(Rana boulengeri)白 细 胞 介 素-34(Interleukin-34,IL-34)基 因 的 信 息 和 该 基 因 组 织 表 达 特 性。【方法】基于实验室构建的棘腹蛙皮肤转录组数据库,采用反转录PCR从棘腹蛙皮肤组织中克隆IL-34 基因的全长c DNA序列,并用荧光定量PCR法检测IL-34 基因在棘腹蛙各组织中的表达情况。【结果】棘腹蛙IL-34 基因的c DNA全长为864bp,包含564bp的开放阅读框,编码187个氨基酸;预测IL-34理论分子量大小为70.56k Da,理论等电点为4.85。荧光定量PCR分析表明IL-34 基因在棘腹蛙皮肤、脑、肝脏、脾脏、胃、肌肉等组织中均有表达,在脾脏组织中表达量最高。【结论】成功克隆了棘腹蛙IL-34 基因并探明了它的组织表达模式,为深入研究棘腹蛙IL-34的生物学功能提供了理论依据。
     

大黄鱼Rac2基因的克隆及其抗病免疫作用分析

克隆了大黄鱼ras-related C3 botulinum toxin substrate 2(Rac2)基因(命名为lycRac2),并从本实验室大黄鱼基因组数据库中获得了lycRac2基因的全长序列。lycRac2基因全长1670.427 kb,包含7个外显子、6个内含子,其c DNA序列全长1221 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸。同源性比较结果显示,从鱼类到哺乳动物,RAC2蛋白的氨基酸序列相当保守,其基因均具有7个外显子和6个内含子,但不同物种之间7个外显子和6个内含子的长度都不一致。实时定量PCR检测结果显示,lycRac2基因在肝脏、脾脏、肠、胃、肾、头肾、肌肉、皮肤、脑、鳃、心脏、血液中均有不同程度表达,其中在头肾中表达量最高,肌肉中表达量最低。大黄鱼受到LPS(脂多糖)、poly I:C、副溶血弧菌刺激后,肝脏、脾脏、头肾中lycRac2基因表达量明显上调,显示lycRac2基因参与了大黄鱼的免疫反应,其可能具有对细菌和病毒的抗病免疫作用。通过原核表达还获得lycRAC2蛋白,为进一步研究其性质和功能奠定了基础。     

日本鳗鲡抗菌蛋白BPI基因的克隆、鉴定与表达

为探究鱼类抗菌肽—杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)的功能,从日本鳗鲡(Anguilla japonica)中克隆和鉴定了两个BPI基因,命名为AJBPI-1和AJBPI-2。这两个抗菌肽均具有BPI超家族特征性的LPS结合结构域和脯氨酸富集区,其中AJBPI-1和AJBPI-2的N-端碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)的数量分别为12和35,表明前者对LPS的结合力较后者弱。Real-time PCR检测结果显示,AJBPI-1在正常养殖鳗鲡的肝脏中转录表达量最高,其次是头肾,而AJBPI-2则在中肾和头肾中转录表达量最高,其次是血液。Poly I:C和E.tarda诱导后,鳗鲡脾脏中AJBPI-1和AJBPI-2的表达量均显著上调(P0.05),AJBPI-1约为PBS对照组的4.0倍和3.3倍,AJBPI-2为PBS对照组的2.3倍和1.7倍;经LPS、Poly I:C和E.tarda刺激后,鳃中AJBPI-2表达量显著上调(P0.05),上调幅度最高可达到PBS组的2.5倍、17.0倍和7.0倍;而中肾只在LPS和Poly I:C刺激时,AJBPI-1和AJBPI-2的表达量显著上调(P0.05),AJBPI-1约为PBS对照组的3.0倍和2.2倍,AJBPI-2为PBS对照组的2.0倍和2.2倍。     

苯并(a)芘、三丁基锡及其混合物对褐菖鲉溶菌酶活力的影响

以褐菖鲉为材料,每周1次腹腔注射浓度为0.5、1、5、10 mg/kg的苯并(a)芘、三丁基锡及两者的等比例混合物,观察鱼体肾脏、脾脏组织中溶菌酶活力的变化.结果表明,实验浓度的苯并(a)芘、三丁基锡对褐菖鲉肾脏、脾脏中的溶菌酶活力均有一定程度的诱导激活作用,而两者混合暴露56 d后显著抑制溶菌酶活性,表明这两种有机污染物在长时间联合作用下,对褐菖鲉非特异免疫能力会产生不利影响.     

牦牛GRB2基因克隆及其在生殖轴的表达研究

生长因子受体结合蛋白2(GRB2)是一种信号转导分子,通过细胞信号传导参与细胞增殖和分化过程.为了探讨GRB2基因在牦牛繁殖中的调控作用,采集5头成年母牦牛和5头母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管和子宫组织,利用反转录PCR、生物信息学分析方法和RT-qPCR技术进行GRB2基因克隆、蛋白质结构预测及在生殖轴组织表达检测.结果表明,牦牛GRB2基因的CDS全长为654 bp,编码217个氨基酸,与黄牛、绵羊和山羊的同源性高,蛋白质一级结构中天冬氨酸所占比例最高,无跨膜结构和信号肽.二级结构主要包括自由卷曲、延伸链和α螺旋,三级结构的分析结果与二级结构相似.细胞定位分析发现GRB2蛋白主要存在于细胞核和细胞质中.RT-qPCR结果显示GRB2基因在牦牛下丘脑和脑垂体前叶表达量显著高于输卵管、卵巢和子宫(P0.05);GRB2基因在黄牛脑垂体前叶和卵巢表达量显著高于牦牛(P0.05),而在两物种的其余三个组织没有显著差异(P0.05).推测GRB2基因可能影响母牦牛的繁殖能力.     

醋制泥鳅对游泳训练并力竭小鼠心肌HGF和MHC基因表达的影响

本文探讨了醋制泥鳅对小鼠运动耐力的影响机制.将24只健康雄性ICR小鼠分为安静对照组(A组)、运动训练组(T组)、泥鳅运动组(V组).T组与V组小鼠游泳训练三周后进行力竭游泳,24 h后取材计算心系数,HE染色光镜下观察心肌组织,RT-PCR法检测心肌肝细胞生长因子(HGF)和肌球蛋白重链(MHC)基因的表达.结果表明:V组小鼠的力竭游泳时间非常显著地长于T组(P0.01);T组的心系数显著高于A组和V组(P0.05),并可见心肌细胞界限模糊、心肌纤维断裂和间质水肿,而A组与V组无明显病理表现;与A组比较,T组的HGF、β-MHC mRNA表达显著增高(P0.05)和α/β-MHC mRNA比值显著降低(P0.05),V组的HGF、MHC mRNA和α/β-MHC mRNA值差异不显著(P0.05);V组的α/β-MHC mRNA值显著高于T组(P0.05).总之,醋制泥鳅能明显提高负荷游泳训练小鼠的运动耐力,与减轻心肌损害和促进心肌MHC mRNA表达比值的稳定关系密切.     

不同福利条件下ICR小鼠肝细胞NF-κB表达的比较

目的比较不同福利水平下ICR小鼠肝脏NF-κB的表达。方法选取6周龄雄性ICR小鼠,交叉使用制动和丰富环境干预形成不同的福利环境,观测小鼠的体质量增重、饲料能效及脾脏系数,ELISA法测定血清IL-2和CORT,实时定量PCR和免疫印迹法分别检测小鼠肝细胞内NF-κB p65的mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组相比,丰富环境组小鼠的体质量增重显著提高(P0.05),其他指标无差异(P0.05);丰富环境+制动组小鼠的体质量增重、脾脏系数显著低于对照组(P0.05),而CORT、NF-κB p65的基因和蛋白表达显著高于对照组(P0.05);制动组的体质量增重、饲料能效、脾脏系数及血清IL-2均显著低于对照组(P0.05),CORT、NF-κB p65的基因和蛋白表达均显著高于对照组(P0.05)。其中制动组的体质量增重显著低于丰富环境+制动组(P0.05),CORT、NF-κB p65的基因和蛋白表达显著高于丰富环境+制动组(P0.05)。结论不同组别小鼠存在福利水平差异,NF-κB表达差异与福利差异相类似,福利水平与NF-κB表达水平之间存在紧密关联。     

大黄鱼trim38基因的克隆及其表达分析

］由变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）引起的大黄鱼（Larimichthys crocea）内脏白点病的死亡率可达50%~80%。对抗病相关基因trim38进行了分子及表达特征等分析。结果显示:该基因开放阅读框（ORF）1623 bp，编码540个氨基酸，预测蛋白分子量为61.58 ku，等电点6.99。qRT-PCR的结果表明，在所有检测的组织中都发现了trim38的转录产物，但在肾脏中的相对表达量最高。变形假单胞菌攻毒刺激后，大黄鱼脾脏中该基因持续表达，在120 h达到峰值；肝脏中3 h显著表达，之后相对表达量降低；肾脏中该基因相对表达量变化不大，在96 h左右达到最大值。上述结果表明trim38基因参与了大黄鱼应对变形假单胞菌感染的抗病免疫过程。