中华绒螯蟹基因组研究概述

概述了近年来中华绒螯蟹基因组研究的进展情况，现已对13种基因的核苷酸序列进行了分析，并通过概念性翻译获得了8种蛋白质(或其亚基)的氨基酸序列，还对中华绒螯蟹的微卫星序列和序列表达标签开展了初步研究，总体上，中华绒螯蟹基因组研究较薄弱，处于起步阶段．今后应加强中华绒螯蟹基因组的广泛深入研究，重点突破一些重要功能基因的结构与功能的分析，为中华绒螯蟹的遗传改良提供理论基础。     

绒螯蟹的分类与中华绒螯蟹种质资源研究进展

绒螯蟹主要有新绒螯蟹属(Neoeriocheir)和绒螯蟹属(Eriocheir)两个有效属,新绒螯蟹属仅有狭颚绒螯蟹(N.leptognatha)一个有效种,绒螯蟹属有直额绒螯蟹(E.recta)和日本绒螯蟹(E.japonica)两个有效种,日本绒螯蟹有日本绒螯蟹指名亚种,日本绒螯蟹中华亚种和日本绒螯蟹合浦亚种3个不同的地理亚种.分布在我国大陆的是日本绒螯蟹中华亚种和日本绒螯蟹合浦亚种.中华绒螯蟹在我国大陆被按水系分成南方组与北方组,组内水系间为同种不同地理种群.利用RAPD等分子生物学技术,可以鉴别出中华绒螯蟹的中华亚种和合浦亚种,各种群间的鉴别还有待于进一步研究.     

用cDNA芯片技术筛选中华绒鳌蟹卵巢发育相关基因

为了克隆中华绒螯蟹卵巢发育相关基因,我们构建了中华绒螯蟹卵巢差减cDNA文库.本研究用cDNA芯片技术对中华绒螯蟹卵巢差减cDNA文库进行了初步筛选,并从cDNA芯片筛选的正向差减文库中随机选取50个克隆进行序列测定.结果共获得2倍以上差异表达克隆167个,其中Ⅲ期高表达克隆104个,Ⅱ期高表达克隆63个.正向差减文库中共获得7个独立的EST(expressed sequence tag, EST).同源性分析结果表明,这些EST皆为新的EST, dbEST登录号分别为:CA591892、CA591893、CA591894、CA591895、CA591896、CA591897和CA591898.本研究结果为进一步克隆中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的全长cDNA序列并研究其功能,阐明中华绒螯蟹卵巢发育的分子机理奠定了重要的前期工作基础.     

中华绒螯蟹线粒体COⅡ基因全序列测定

通过克隆测序方法,报道了中华绒螯蟹（Eriocheir japonica sinensis)线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ(COⅡ）基因全序列,与已知甲壳动物线粒体同源序列的比较显示,绒裂蟹COⅡ基因的核苷酸组成及其编码的氨基酸组成与软甲类甲壳动物最相近似。其序列组成与密码子使用对A、T核苷酸没有明显的偏倚,对中华绒螯蟹COⅡ全序列及其序列特征的研究,为进一步研究短尾类的系统发生和绒螯蟹属的分子进化提供了分子标记。     

中华绒螯蟹Na+-K+-Cl-协同转运蛋白基因的克隆和功能分析

为研究Na~+-K~+-Cl~-协同转运蛋白(NKCC)基因在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)应对高盐胁迫过程中的作用,采用RACE技术首次克隆到中华绒螯蟹NKCC基因全长序列,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对中华绒螯蟹NKCC基因进行组织定量,并进行生物学信息分析.结果表明:该基因的cDNA全长为4 127bp,其中5非编码区(UTR)长度为18bp,3非编码区(UTR)长度为944bp,开放阅读框(ORF)长度为3 165bp,编码1 054个氨基酸.理化分析预测其分子量为51.066kDa,理论等电点为4.65.预测中华绒螯蟹NKCC二级结构由12个跨膜结构域组成.同源对比结果显示:中华绒螯蟹NKCC的氨基酸序列与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)NKCC相似度最高,为86.17%.系统进化分析表明中华绒螯蟹NKCC与拟穴青蟹、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、可口美青蟹(Callinectes sapidus)、蓝蟹(Callinectes sapidus)聚为一支.不同组织的荧光定量结果显示:NKCC基因在中华绒螯蟹的肠、脑神经节、胸神经节、鳃、胃、肝胰腺、肌肉、眼、心脏和血清中均有表达且在中华绒螯蟹肠的表达量最高.在盐度为25‰的急性胁迫下,NKCC基因在中华绒螯蟹肠中的表达量随着胁迫时间延长变化显著(P0.05),并在胁迫72h后恢复稳定.以上结果显示,NKCC基因参与了中华绒螯蟹渗透压调节,并在其渗透压平衡中发挥重要作用.     

中国大陆绒螯蟹线粒体16SrDNA序列变异与分子鉴定标记

选取了中国大陆东部6个水系合计110个绒螯蟹个体,通过DNA序列测定和PCR/RFLP分析,对线粒体16S rDNA部分片段的序列变异进行研究.结果表明,在401bp的16S rDNA片段中,合浦绒螯蟹(Eriocheir japonica hepuensis)与中华绒螯蟹(E.j.sinensis)之间存在3～4个固定的碱基替代;合浦绒螯蟹的闽江、九龙江和南流江种群之间未发现碱基变异,表现为1种单元型(C型);中华绒螯蟹长江和辽河的种群中,有1个固定的碱基替代,表现为A,B两种单元型.单元型之间的碱基变异反映了绒螯蟹地理种群之间的遗传歧异.经Dra I酶切形成的16S rDNA酶切片段差异,为2个亚种的鉴定提供了一种准确、简捷的DNA分子标记.对长江水系部分水域绒螯蟹的分子鉴定提示,长江下游至长江口以中华绒螯蟹的2个单元型为主,但已混有合浦绒螯蟹的单元型.在江苏、安徽渔场中的饲养种群分别属于单元型A型和B型.16S rDNA的PCR/RFLP差异可作为正确鉴定中华绒螯蟹和合浦绒螯蟹的分子鉴定标记;16S rDNA片段中1个固定位点的碱基替代可作为区分中华绒螯蟹两种单元型的分子鉴定标记.     

莠去津对中华绒螯蟹蜕皮激素分泌的影响

为了研究除草剂莠去津对中华绒螯蟹蜕皮激素分泌的影响,利用不同质量浓度(0.001,0.01,0.1,1mg/L)的莠去津对中华绒螯蟹进行染毒处理,采用酶联免疫吸附技术(ELISA)分析其对中华绒螯蟹血清蜕皮激素含量的影响.结果表明:低质量浓度(0.001,0.01mg/L)以及高质量浓度(1mg/L)莠去津暴露后,中华绒螯蟹血清中蜕皮激素含量相较对照组无显著变化,而中间质量浓度0.1mg/L的蜕皮激素含量则显著低于对照组,该质量浓度下中华绒螯蟹的蜕皮会受到一定的影响.     

中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体COI基因片段的序列比较研究

以相应引物PCR扩增了黄河口中华绒螯蟹线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基基因（COI）片段,PCR产物经T载体连接之后进行了克隆、测序,得到709bp的碱基序列,其A,T,G,C含量分别为34．41％,27．93％,20．03％和17．63％。并比较它与珠江流域中华绒螯蟹COI序列和日本绒螯蟹COI序列的差异,发现黄河口中华绒螯蟹与珠江 流域中华绒螯蟹COI序列完全相同,而与日本绒螯蟹差异非常明显,709或658（不计引物）位点中核苷酸差异数为32,核苷酸差异率为4．51％或4．86％（不计引物）,其中25个位点为转换,7个位点为颠换。作者倾向于支持存在中华绒螯蟹和日本绒螯蟹,或它们为同一种的两个地理亚种的观点。     

渗透压对中华绒螯蟹生精细胞体外培养的影响

渗透压是影响体外培养细胞生长和存活的重要因子.通过6种渗透压梯度下体外培养的生精细胞的贴壁率、存活率及RNA/DNA值的测定和细胞生长状况实验,研究了渗透压对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)生精细胞体外培养的影响.实验结果初步确定了中华绒螯蟹生精细胞体外培养的适宜渗透压范围为900～1 000 mmol/L.     

一个在中华绒螯蟹性腺中特异表达的Sox基因HMG盒区的克隆与鉴定

根据人的睾丸决定因子（SRY）的高速泳动组蛋白区设计简并引物,以中华绒螯蟹雌雄个体的基因组DNA为模板进行PCR扩增,从雌雄体均扩出220bp左右的条带,说明中华绒螯蟹中存在SRY基因的同源体,且无性别差异．经克隆、测序后得到两条SRY盒区相关基因（Sox基因）片段,ES1和ES2,其序列与人相应Sox基因保守区的最高同源性分别为66％和93％．ES1和ES2在成体8种组织中的检测结果表明,ES1在精巢、肌肉、心脏、肝脏、鳃、胸神经团、不同时期的卵巢及排出的成熟卵等组织中均表达,而ES2只在精巢、成熟的卵巢以及排出的成熟卵中有表达,说明ES2基因可能参与性腺的发育和早期胚胎发育过程．     

克隆与序列分析中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）HSP70基因全长ORF的RACE

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Edocheirsinensis)的Hsp70基因并进行序列分析.以中华绒螯蟹卵组织cDNA为模板,克隆测序后拼接得到一条长2 429 bp的cDNA序列,序列分析表明其覆盖了完整编码区,编码649个氨基酸.经antheprot分析发现2个Hsp70基因的签名序列:IFDLGGGTFDVSIL,IVLVGGSTRIPKIQK;Dnak特征基序DLGTF-S-V;非细胞器基序:RARFEEL;核定位信号标签:KKDPSESKRALRRL;胞质Hsp70特征基序GPTIEEVD.经BLASTn和BLASTx软件分析,该编码区核苷酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus uannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)的相似性分别为85.30%和84.89%.根据核苷酸序列所推导出的Hsp70氨基酸序列,其与斑节对虾、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的相似性分别为93.23%和93.40%.本研究克隆了中华绒螯蟹的Hsp70基因,为进一步深入研究锯缘青蟹的抗逆机理及其遗传改良奠定了基础.     

中华绒螯蟹酚氧化酶原系统与颤抖病的关系

近年来,颤抖病给中华绒螯蟹养殖业造成了巨大的经济损失.酚氧化酶原系统是甲壳动物最主要的体液免疫系统,当外源微生物侵入体内时,它发挥最基本的免疫防御作用来抵抗感染.酚氧化酶原系统的变化是蟹类健康状况的重要指标.prophenoloxidase和peroxinectin是酚氧化酶原系统中两个重要的体液免疫分子.实验从分子和蛋白两个水平研究了中华绒螯蟹酚氧化酶原系统与颤抖病的关系,建立了一种新的通过测定酚氧化酶原系统活性来判断蟹体质状况的方法.在分子水平上,中华绒螯蟹体液免疫分子prophenoloxidase和peroxinectin的部分基因序列被克隆和测序,并检测出这两种分子mRNA水平的表达情况与颤抖病的感染程度呈正相关,患病组蟹mRNA的表达水平远高于正常组;在蛋白水平上,酚氧化酶的活性被测定,在正常情况下,蟹体内酚氧化酶活性处于低水平状态,当被感染颤抖病后,酚氧化酶活性有一定程度的升高.这些结果提示了酚氧化酶原系统在抗颤抖病感染时起重要作用,为进一步研究预防和治疗颤抖病的新途径提供了理论依据.     

皖南肺吸虫第二中间宿主—溪蟹类的研究Ⅰ.华溪蟹属一新种与长江华溪蟹的补充描述

华溪蟹科(Sinopotamidae Bott 1970)共包括3属,其中华溪蟹属(SinopotamonBott 1967)为我国特有属。长江华溪蟹(S.Yangtsekiense Bott 1967)为此属中在皖南分布最广,数量最大的一种,对肺吸虫的传播和防治关系最大。本文除对长江华溪蟹进行补充描述外,还报导了一个新种;绩溪华溪蟹(S.Jexiense sp.nov.)。     

皖南肺吸虫第二中间宿主—溪蟹类的研究 Ⅰ.华溪蟹属一新种与长江华溪蟹的补充描述

华溪蟹科(Sinopotamidae Bott 1970)共包括3属,其中华溪蟹属(SinopotamonBott 1967)为我国特有属。长江华溪蟹(S.Yangtsekiense Bott 1967)为此属中在皖南分布最广,数量最大的一种,对肺吸虫的传播和防治关系最大。本文除对长江华溪蟹进行补充描述外,还报导了一个新种;绩溪华溪蟹(S.Jexiense sp.nov.)。     

藏鸡肌肉组织中3条新发现miRNA序列的克隆及靶基因预测

旨在克隆藏鸡不同发育阶段肌肉组织中新发现的差异表达的3条miRNA(miR-13_529,miR-20_1207,miR-24_1302)序列,并对它们的靶基因进行预测,为3条miRNA序列功能的研究奠定基础.随机选择150日龄健康藏鸡,屠宰并采集藏鸡肌肉组织,提取组织总RNA,利用Stem-loop RT-PCR法克隆获得藏鸡3条新发现miRNA序列,利用4个生物信息学预测软件预测3条miRNA序列的靶基因.结果表明,克隆获得miR-13_529序列23bp,miR-20_1207序列21bp,miR-24_1302序列22bp.靶基因预测结果显示,分别能与3条miRNA序列特异性结合的2个、10个和1个靶基因均与肌肉生长发育相关.这些结果表明3条新发现的miRNA序列可能在藏鸡肌肉发育的过程中具有重要的调控作用.     

中华绒螯蟹螺原体类螺旋蛋白SLP25对中华绒螯蟹和RAW264.7细胞免疫反应的研究

中华绒螯蟹螺原体是一种引起中华绒螯蟹颤抖病的新型病原微生物,对中华绒螯蟹养殖业造成了很大的损失.本文研究了螺原体的一个特有蛋白——螺旋蛋白所引起的中华绒螯蟹和小鼠RAW264.7细胞的免疫反应.克隆和原核表达中华绒螯蟹螺原体类螺旋蛋白SLP25后,用以感染中华绒螯蟹和小鼠巨噬细胞RAW264.7,用实时定量PCR和Western Blot的方法检测宿主免疫相关基因或蛋白表达量的变化.类螺旋蛋白SLP25刺激后,中华绒螯蟹的抗脂多糖因子、酚氧化酶原、消极素轻链和Peroxiredoxin 6等基因的mRNA表达量变化显著;RAW264.7细胞内的TNF-α、IL-1β和IL-10等基因的mRNA表达量变化显著,而TGF-β1和CD40的mRNA表达量变化不显著;同时RAW264.7细胞内P38和ERK蛋白的磷酸化水平变化显著,而JNK蛋白的磷酸化水平变化不显著.通过本文的研究表明类螺旋蛋白SLP25可以引起宿主广泛的免疫变化,进而证明其是重要的毒力相关因子.     

中华绒螯蟹不同生理时期肌肉组织中同工酶的分析比较

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对中华绒螯蟹附肢肌肉中乳酸脱氢酶(LDH)、醇脱氢酶(ADH)、酯酶(EST)、苹果酸脱氢酶(MDH)、过氧化物酶(P()D)及淀粉酶(AMY)等同工酶进行了比较分析,结果表明中华绒螯蟹附肢肌肉在不同生理阶段同工酶的表达上具有一定特异性。     

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素多克隆抗体的制备及其表达分泌特征的组织学研究

为了探讨中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)蜕皮抑制激素(molt-inhibiting-hormone,MIH)的表达分泌特征,利用分子生物学技术构建了表达载体pET-30a-MIH,并制备了MIH的兔抗多克隆抗体.制备出的多克隆抗体用于MIH在中华绒螯蟹视上神经节的免疫组织化学研究.结果显示,眼柄视上神经节分泌细胞中细胞类型1,2,3,4都参与了MIH的分泌,窦腺也呈现阳性反应.     

中国明对虾和中华绒螯蟹EST的Blast2GO注释及其在免疫基因分布研究中的应用

以dbEST数据库中公布的中国明对虾和中华绒螯蟹的EST序列作为数据源,利用CAP3对其进行聚类拼接,采用Blast2GO软件进行功能注释,并通过查找免疫相关的GO注释和检索免疫关键词的方法寻找免疫相关基因,经与不同物种免疫基因的比较,推测可能的免疫基因序列,并进一步分析免疫基因在不同组织和细胞中的分布.结果表明,通过注释和关键词进行筛选这2种方法具有较好的互补性;预测了位于中国明对虾头胸部的60个可能的免疫基因以及位于中华绒螯蟹血细胞hemocyte、haemocyte、肝胰腺、性腺和精巢中的250个免疫基因,这些基因包括模式识别受体、抗氧化蛋白、抗菌肽、凝集素等,其中部分参与酚氧化酶原激活系统、Toll信号通路等重要免疫过程.中华绒螯蟹血细胞中具有种类丰富的免疫基因,与已有的甲壳动物免疫系统相符合.肝胰腺中发现了模式识别蛋白、蛋白酶以及数量众多的凝集素种类,提示肝胰腺在免疫过程中也发挥了一定作用.     

氯化汞对中华绒螯蟹幼蟹蜕皮、生长和存活的影响

通过向水体添加不同浓度的汞(Hg2+),观察其对中华绒螯蟹幼蟹(2.01士0.16)g的毒性影响.结果表明,Hg2+对其24,48,72,96 h的半致死浓度(LC50)分别为0.542 8,0.471 6,0.433 2和0.342 3 mg/L.中华绒螯蟹幼蟹在0,0.01,0.05,0.10,0.20,0.30 mg/L的Hg2+条件下饲养40 d后,各浓度组幼蟹存活率分别为96.67%,86.67%,73.33%,63.33%,56.67%,43.33%;增重率和蜕皮率随着Hg2+浓度的升高而降低.可见水体中的Hg2+能够抑制中华绒螯蟹的生长和蜕皮,高浓度的Hg2+甚至会造成幼蟹的死亡.根据Hg2+对中华绒螯蟹的毒性作用确定水体中汞的最大允许量为0.034 2 mg/L.