MEK5$\alpha $ 和 MEK5$\beta $ 调控 ${\bf Beclin}$ 1 启动子

Beclin 1是哺乳动物自噬相关基因, 调控自噬起始和自噬体成熟. 在肌肉分化过程中, Beclin 1 基因表达上调, 自噬增加; 此外 MEK5-ERK5 信号活化并调控成肌细胞分化. 因此, 在肌肉分化过程中, MEK5-ERK5 信号通路可能调控 Beclin 1 基因表达. 目的是阐明 MEK5 对成肌细胞 Beclin 1 基因启动子活性的调控. 将不同长度 Beclin 1 启动子片段克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic并转染成肌细胞C2C12. 双荧光素酶报告基因检测实验结果显示, 含 Beclin 1 基因起始密码子上游 586 碱基对 DNA 片段的载体(p-354)具有强荧光素酶活性. MEK5$\alpha $显著增加 p-354 荧光素酶活性, 并有剂量依赖性; 而 MEK5$\beta $ 显著降低 p-354 荧光素酶活性. MEK5$\beta $能够拮抗 MEK5$\alpha $对 p-354 荧光素酶活性的调控. 与 MEK5 对 Beclin 1 基因启动子调控结果一致, MEK5$\alpha $CA 上调细胞Beclin 1 mRNA 表达, MEK5$\beta $DD 下调 Beclin 1 mRNA 表达, 并且 MEK5$\beta $DD 抑制 MEK5$\alpha $CA 对 Beclin 1 mRNA 表达的促进作用. 此外, 转录因子 CREB 家族成员 CREB3, CREBP 和 CREBL1 能够显著上调 p-354 荧光素酶活性. CREB3 呈剂量依赖性显著上调 p-354 荧光素酶活性, 并与 MEK5$\alpha $ 具有协同效应. MEK5$\alpha $ 和 MEK5$\beta $ 对 Beclin 1 启动子具有不同调控作用, CREB 可能是其下游效应因子.     

Pax5启动子的克隆及其在人淋巴瘤细胞系HL-60中转录因子的确定

克隆Pax5基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性;采用PCR技术从人淋巴瘤细胞系HL-60基因组中扩增出Pax5启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性;测序结果表明扩增的Pax5启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,转录因子SP1和Runx1能以剂量依赖的方式提高Pax5报告基因的转录活性;克隆了Pax5启动子,并发现转录因子SP1和Runx1能够调控Pax5的转录。     

GATA-3启动子报告基因载体构建及其活性鉴定

目的转录因子GATA-3在人乳腺癌的发生发展中扮演重要的角色,研究其转录调控有重要意义.方法从人乳腺癌细胞系MCF-7提取基因组DNA为模板,以PCR方法扩增获得GATA-3启动子序列,将片段克隆到pGL3-Basic载体内,鉴定后通过报告基因检测系统检测GATA-3启动子报告基因的荧光素酶活性.结果双酶切、基因测序鉴定结果显示,成功构建了GATA-3启动子报告基因,并在MCF-7细胞内鉴定了其具有荧光素酶的表达活性.结论本实验成功构建了GATA-3启动子报告基因载体pGL3-GATA-3pro-Luc,为后续GATA-3在乳腺癌中表达及其调控通路以及以GATA-3为靶标的抗肿瘤药物研究提供了有效工具.     

人cidec基因启动子的克隆及 PPARγ 上调其活性大小比较研究

人诱导细胞死亡的 DFF45 样效应因子 C(Cell death-inducing DNAfragmentation factor 45-like c,cidec)可调节脂肪代谢,与动脉粥样硬化有密切联系,研究显示该因子表达受到过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(Peroxisomeproliferator-activated receptor gamma,PPARγ)的调节,但其中的表达机制还不清楚。从人肝癌细胞 HepG2 中扩增 cidec基因启动子不同长短片段,分别克隆到虫荧光素酶报告基因载体中;cidec 基因启动子片段重组报告基因质粒转染HepG2 细胞,经 PPARγ 激动剂罗格列酮(Rosiglitazone,ROZ)处理后,检测荧光素酶活性。结果发现,cidec 基因启动子(-1 800～+150 bp)加 ROZ 前后均无明显变化,而 cidec 基因启动子(-2 289～+150 bp)质粒荧光素酶活性明显增加,且加 ROZ 后活性显著升高(p<0.05)。这表明激活 PPARγ 可能通过 cidec 基因启动子的-2 289～-1 800 bp 区域 PPARγ结合元件而上调该基因转录活性。
     

人MTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

人MTERF3基因编码线粒体基因转录和能量代谢的负调控因子。采用PCR技术对人MTERF3基因5'侧翼上游1251 bp启动子序列进行扩增,并将其克隆至荧光素酶表达载体p GL6-TA,构建人MTERF3基因启动子荧光素酶报告基因质粒。经酶切、测序鉴定后,将其用脂质体转染体外培养的HEK293细胞株,利用双荧光素酶测定系统检测其表达活性。研究结果表明,克隆获得的1251 bp DNA序列与Gen Bank报道的一致,且插入方向正确。含人MTERF3基因启动子的报告基因荧光素酶的表达活性显著提高(P0.05),约为对照组(空载体p GL6-TA)的9.8倍。本研究通过对人MTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶表达载体构建与表达活性的测定,为进一步阐明人MTERF3基因表达的调控机制奠定实验基础。     

赤狐ESR1基因启动子的克隆及生物信息学分析

对赤狐ESR1基因启动子区转录因子结合位点进行了预测,为今后研究其转录调控机制提供参考依据.以赤狐基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增克隆ESR1基因启动子序列,并构建至双荧光素酶报告基因载体;利用生物信息学方法对ESR1基因核心启动子区的关键转录因子结合位点进行预测.成功克隆出赤狐ESR1基因5'上游1880 bp...     

风车子抑素A4对人脐静脉内皮细胞的抑制增殖与诱导自噬作用研究

目的研究自噬在风车子抑素A4(Combretastatin A4,CA4)抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖中的作用,探讨CA4抑制血管生成的机制。方法体外培养HUVECs,采用不同浓度的CA4处理HUVECs,药物作用不同时间后用MTT法检测CA4对细胞存活率的影响,MDC染色检测10n M CA4处理不同时间自噬小体变化的情况,RT-PCR检测自噬相关基因LC3B和Beclin 1基因转录水平的变化,Western Blot检测LC3B和Beclin1的蛋白表达水平的变化。结果 CA4能抑制HUVECs增殖并在一定范围呈浓度依赖性和时间依赖性;10n M CA4处理12小时和24小时自噬小体显著增加,诱导HUVECs自噬;荧光定量PCR结果显示自噬相关基因LC3Ⅰ表达下调、LC3Ⅱ表达上调,LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值显著上调,Beclin 1表达上调;Western Blot结果与荧光定量PCR结果一致,但m TOR蛋白未见明显变化。结论 CA4能显著抑制HUVECs增殖和诱导HUVECs自噬。     

人WDR79基因启动子表达载体的构建及鉴定

人WDR79是一种重要的支架蛋白,在端粒酶组装、卡哈尔体(Cahar body)形成和DNA损伤修复等过程中发挥着重要作用。采用PCR扩增技术获得人WDR79基因启动子上游DNA序列,构建人WDR79基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-WDR79-promoter;通过双酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA测序和荧光素酶活性测定等实验手段,验证质粒pGL3-WDR79-promoter构建的正确性及其表达活性。本研究结果为进一步探讨人WDR79基因表达的调控机制奠定实验基础。     

PMA对人肝癌细胞中Ha-ras基因启动子活性的影响及与PKC活性的相关性

为探讨佛波脂PMA的生物作用与癌基因ras表达及与PKC信号通路的相关性,用人肝癌细胞BEL-7402为模型,以荧光素酶为报告基因观察了PMA对Ha-ras启动子活性的影响.当用100μg/L PMA长期处理人肝癌细胞BEL-7402时,可明显抑制肿瘤细胞生长.通过RT-PCR和Western Blot分析发现,PMA处理后的BEL-7402细胞中Ha-ras mRNA和蛋白水平均明显下降.进一步观察了PMA对Ha-ras基因启动子活性的影响.通过构建含有Ha-ras启动子序列的、以荧光素酶为报告基因的pGL3-ras真核表达载体,利用脂质体瞬时转染技术将其转入BEL-7402细胞中,并通过荧光素酶活性的检测,发现PMA作用48和72h后的BEL-7402细胞中,Ha-ras启动子活性分别被抑制了55%和54%,同时PKC活性分别下降了76.7%和75.7%.并进一步观察到PKCα和βⅠ蛋白水平明显降低.实验结果表明,PMA长期处理的人肝癌细胞可通过抑制Ha-ras启动子的活性使Ha-ras基因表达被抑制,并且可能与PKC信号通路有关.     

人MiTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

人MiTERF3基因编码线粒体基因转录和能量代谢的负调控因子。采用PCR技术对人MiTERF3基因5''侧翼上游1251 bp启动子序列进行扩增,并将其克隆至荧光素酶表达载体pGL6-TA,构建人MiTERF3基因启动子荧光素酶报告基因质粒。经酶切、测序鉴定后,将其用脂质体转染体外培养的HEK293细胞株,利用双荧光素酶测定系统检测其表达活性。研究结果表明,克隆获得的1251 bp DNA序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。含人MiTERF3基因启动子的报告基因荧光素酶的表达活性显著提高（P<0.05）,约为对照组（空载体pGL6-TA）的9.8倍。本研究通过对人MiTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶表达载体构建与表达活性的测定,为进一步阐明人MiTERF3基因表达的调控机制奠定实验基础。     

异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5′端调控区启动子片段的克隆与分析

通过PCR技术从异源四倍体鲫鲤基因组DNA中分离到Sox4基因部分基序.序列分析表明,其5′端调控区具有多种启动子所特有的序列元件,如TATA框,CAAT框等,据此推测,它具有启动子活性.采用高保真PCR方法克隆了异源四倍体鱼Sox4基因5′端调控区600bp启动子片段,将其插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建重组载体pAtsox4EGFP-1.通过瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下可检测到绿色荧光.结果表明,克隆的Atsox4基因5′端调控区具有启动子活性,并成功构建了含四倍体鱼Sox4基因启动子片段的报告基因载体,为以后研究Sox4基因表达调控的分子机制奠定了基础.     

MicroRNA-214在慢性心衰大鼠心肌细胞钙调控中的作用与机制研究

证实microRNA-214参与慢性心衰大鼠心肌细胞钙调控过程,并揭示其内在作用机制.冠脉结扎法诱导大鼠慢性心衰模型.实时定量PCR结果显示与假手术组比,心衰组大鼠左心室miR-214表达显著上调(P0.05),Western blot实验法结果显示与假手术组比,心衰组大鼠左心室L-型钙通道β1亚基(Cavβ1)表达显著下调(P0.05).左心室局部肌肉注射agomiR-214导致假手术组和心衰组大鼠左心室收缩压(LVSP)、L-型钙通道电流密度、L-型钙通道β1亚基(Cavβ1)表达均显著降低(P0.05).荧光素酶报告基因实验结果显示miR-214能够调节心肌细胞L-型钙通道β1亚基基因CACNB1的表达.结果提示microRNA-214参与慢性心衰大鼠心肌细胞钙调控过程,其机制可能与microRNA-214抑制心肌细胞L-型钙通道β1亚基(Cavβ1)表达有关.     

G1期细胞周期相关蛋白对POLD1基因启动子活性的调控

POLD1基因编码DNA聚合酶δ的催化亚基.然而作为最重要的复制蛋白,目前并不清楚其表达的细胞周期调控机制.研究中运用细胞周期同步化及荧光素酶报告基因测定了POLD1启动子在细胞周期不同时相的活性,结果显示启动子活性随着细胞周期进程而变化,在早S期最高.为进一步确定调控POLD1表达的细胞周期相关因子,应用不同质粒转染MCF7细胞,分别筛选得到稳定细胞系.荧光素酶实验表明增强p53或p21的表达,抑制CyclinE或CDK2的表达都能抑制POLD1启动子活性;而抑制CDK4或Cyclin D1的表达对启动子活性没有明显影响.瞬时共转染实验进一步验证Cyclin E或CDK2受到抑制后能够降低POLD1启动子活性.研究初步探讨了POLD1基因表达的细胞周期调控通路,进一步了解细胞周期因子对DNA复制体调控的复杂机制.     

PPARα活化增加肿瘤细胞对EGCG的敏感性的机制

 研究探索EGCG是否调节PPARα以及PPARα活化对EGCG的肿瘤抑制作用影响及其机制。首先利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率,之后分别采用western blotting和real-time PCR检测蛋白质和mRNA表达水平;采用PPARα的特异性激动剂和特异性拮抗剂来改变PPARα的表达;应用荧光素酶报告基因系统及染色质免疫共沉淀研究PPARα对HO-1的调控。结果表明,随着EGCG浓度的增加,PANC1和A2780细胞的存活率逐渐下降。当EGCG处理肿瘤细胞后,PPARα蛋白水平会随着EGCG剂量的提高而增加。PPARα的特异性激动剂—氯贝特(clofibrate)能增加胰腺癌PANC1和卵巢癌A2780细胞对EGCG的敏感性,其机制是氯贝特能够抑制细胞保护性血红素加氧酶-1(HO-1)的诱导。荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验(ChIP)表明,活化的PPARα能结合到HO-1启动子上的PPAR结合元件(PPRE)上并抑制HO-1的表达。研究表明,PPARα的活化能在转录水平对HO-1进行负调控,同时增加肿瘤细胞对EGCG的敏感性。     

P53亚细胞定位变化对POLD1基因启动子活性的影响

POLD1基因编码DNA聚合酶δ(polδ)的催化亚基.体外实验表明p53能够抑制POLD1基因启动子活性.文中探讨p53是否在细胞内直接与POLD1启动子结合调节POLD1基因表达.在瞬时转染pEGFP-p53重组质粒的人乳腺癌MCF7细胞中,p53表达增强;RT-PCR结果显示POLD1基因mRNA表达受到抑制.染色体免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验证明p53在细胞内与POLD1启动子直接结合抑制其启动子活性.荧光显微镜观察发现EGFP-p53在G1期进入细胞核而在S期和G2期则被转运至细胞质.在稳定表达的pEGFP-p53细胞系中,细胞周期同步化后POLD1启动子活性在细胞周期各时相均处于较低水平.证明了细胞内p53高表达后通过直接与POLD1启动子结合而抑制POLD1基因表达,且这种抑制作用不受细胞周期进程的影响.     

山慈菇正丁醇提取物对NR8383细胞分泌的IL-1β和TNF-α水平的影响

为了探讨山慈菇正丁醇提取物对NR8383细胞(大鼠肺泡巨噬细胞)分泌的白介素-1β(interleukin-1,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平的影响,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)法检测TNF-α和IL-1β的mRNA水平,利用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中TNF-α和IL-1β的蛋白含量。结果显示:与空白对照组相比,终浓度1. 25 mg/m L的山慈菇正丁醇提取物可极显著降低R8383细胞分泌TNF-αmRNA水平和蛋白含量(P 0. 01);与空白对照组相比,终浓度1. 25 mg/m L山慈菇正丁醇提取物能极显著升高IL-1β的mRNA水平和蛋白含量(P 0. 01),同时0. 012 5 mg/m L山慈菇正丁醇提取物能极显著降低IL-1β的mRNA水平和蛋白含量(P 0. 01)。说明终浓度为1. 25 mg/m L的山慈菇正丁醇提取物可极显著调控NR8383细胞分泌的TNF-α和IL-1β的基因和蛋白含量。     

myocardin通过激活miR-93-5p促进人主动脉血管平滑肌细胞分化

myocardin是促进平滑肌细胞分化的重要转录因子.微小RNA(microRNAs,miRNA)在近年来已经证实参与多种生物学过程,包括平滑肌的表型转化.然而在平滑肌分化过程中myocardin与哪些microRNA具有相关性仍有待于阐明.通过将外源性myocardin转入人主动脉血管平滑肌细胞(human aortal vascular smooth muscle cells,HA-VSMCs)中,利用免疫印迹(Western blot)检测分化标志基因肌动蛋白α2(actin alpha2,ACTA2)和肌动蛋白相关蛋白(smooth muscle 22 alpha,SM22α)的表达;利用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检测过表达或敲低myocardin对miR-93-5p水平的影响;构建miR-93-5p启动子的荧光素酶报告质粒,利用荧光素酶报告分析证实myocardin对mi R-93-5p启动子的转录激活作用.上述结果证实myocardin可能通过激活miR-93-5p的转录,上调其表达,进而促进血管平滑肌细胞的分化.     

绵羊oar-miR-200b对GNAQ基因的表达调控

为了探讨mi R-200b是否通过靶向作用GNAQ基因并以此调控发情过程,本研究通过双荧光素酶报告基因系统,验证mi R-200b对靶基因GNAQ的真实干扰作用,并在下丘脑神经细胞和卵巢颗粒的细胞中过表达mi R-200b,用荧光定量PCR检测了GNAQ下游基因的表达变化。结果显示:共转染GNAQ-3'UTR-psi-CHECKTM-2和pri-mi R-200b-pc DNA3.1(+)组的hela细胞荧光素酶值是只转染psi-CHECKTM-2组的77.5%,其余两组与只转染psi CHECKTM-2组之间的差异无统计学意义。通过mi R-200b干扰载体转染下丘脑神经细胞,选择GNAQ下游基因ITPR、PRKCB、GNA1、CREB、MAP3K1、GPR54、KISS1及Gn RH进行实时荧光定量检测,结果发现:mi R-200b干扰组和对照组相比,GNAQ基因显著下调,下游ITPR、PRKCB、GNA1和MAP3K1、发情关键基因GPR54、KISS1和Gn RH显著上调。通过mi R-200b干扰载体转染卵巢颗粒细胞,选择GNAQ下游基因COMT、HSD3B1、CYP1A1和PKA基因进行表达量验证,结果表明:mi R-200b干扰后,GNAQ基因表达量升高,下游基因COMT、HSD3B1、CYP1A1和PKA表达量下降。由此推测,mi R-200b真实靶向调控GNAQ基因,进而调控发情过程。     

miR-9-5p靶向调控ZAK对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:阐明miR-9-5p通过靶向调控ZAK表达从而影响结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的分子机制。方法:通过qPCR、Western blot检测结直肠癌细胞系(HCT116、SW260、HT29及LoVo)及结直肠癌患者组织样本中miR-9-5p表达水平及ZAK的mRNA和蛋白表达水平。生物信息学方法分析miR-9-5p与ZAK结合的靶向序列。双荧光素酶基因报告实验检测miR-9-5p对ZAK的靶向调控关系。脂质体法将miR-9-5p mimic或/和ZAK质粒共转染结直肠癌细胞系HCT116及SW620,通过CCK-8及克隆形成实验观察miR-9-5p/ZAK信号轴对细胞增殖的影响，通过Transwell观察对细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:与人正常上皮细胞系相比，在结直肠癌细胞系中ZAK的mRNA及蛋白水平显著上调(P<0.05);在结直肠癌临床组织样本中，ZAK蛋白水平亦显著上调(P<0.05);miR-9-5p的表达水平在癌细胞系及组织样本中下调(P<0.05)。双荧光素酶报道基因实验显示miR-9-5p能显著影响ZAK 3’UTR野生型表达载体的荧光素酶...     

积雪草苷调控miR-342-5p/AQP3轴保护IL-1β诱导的软骨细胞损伤

目的 探讨积雪草昔(Ass)对白细胞介素1B(IL-1B)诱导的软骨细胞损伤的影响及作用机制。方法 不同 浓度的Ass作用IL-1B诱导软骨细胞24 h,流式细胞仪检测细胞凋亡,酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中白细 胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-342-5p和水通道蛋白3 (AQP3)mRNA表达水平,Western Blot法检测B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)和AQP3蛋 白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-342-5p与AQP3靶向关系。转染miR-342-5p抑制剂或AQP3过表达载体至软骨细胞,上述相同方法检测抑制miR-342-5p表达或AQP3过表达对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡及IL- 6和TNF-α表达的影响。结果 Ass可抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡率、Bax蛋白、IL-6和TNF-α表达及miR- 342-5p表达(P <0. 05),促进Bcl-2蛋白、AQP3 mRNA和蛋白表达(P <0.05)。miR-342-5p在软骨细胞中负调控 AQP3表达。抑制miR-342-5p或AQP3过表达后,IL-1&诱导的软骨细胞凋亡率、Bax蛋白、IL-6和TNF-α表达降低 (P <0. 05) ,Bcl-2蛋白表达升高(P <0.05)。抑制AQP3表达逆转了抑制miR-342-5p对IL-1β诱导的软骨细胞凋 亡、Bax和Bcl-2蛋白及IL-6和TNF-α表达的影响。结论 Ass可抑制IL-1β诱导软骨细胞凋亡和炎症反应,其可 能通过调控miR-342-5p/AQP3保护软骨细胞损伤。