芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

根据已知的枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得了长约1.1kb不含有信号肽序列的植酸酶phyC基因表达片段.经T载体克隆及序列测定后,构建毕赤巴斯德表达载体pPIC3.5K-phyC,并电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子,并进行了诱导表达.SDS-PAGE分析表明:表达产物分子量为42.01KD,表达量占细胞可溶性总蛋白的24%,并具有植酸酶的生物学活性.酶学性质分析结果显示:胞内表达的植酸酶酶促反应最适pH值为7.5;最适反应温度为70℃;经90℃处理10min,残留酶活性42% 均优于出发菌株天然植酸酶的相应性质.     

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。     

酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建

以从原核表达载体中酶切得到的tps1基因为模板，设计适当的引物，利用PCR技术，克隆出核苷酸数大约1.5k的片段，PCR产物经回收后，与PCAMBIAI303载体连接并转化大肠杆菌DH5a，阳性重组子经PCR鉴定，结果表明已获得海藻糖磷酸合成酶基因的植物表达载体。     

酿酒酵母GPDH1基因表达载体pPIC3.5K-ScGPD的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

将酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1的编码序列构建到表达载体pPIC3．5K中，利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中，利用含有G418的YPD平板筛选到两个阳性转化子，通过分子生物学及外源蛋白表达实验证明，酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上，并且得到了预期的表达。     

绿色木霉EG Ⅲ基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

通过RT-PCR从绿色木霉AS3.3711中克隆得到EG Ⅲ基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉eg3的同源性为99.6%.将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2.489,通过SDS-PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析.结果表明:转化子有明显的重组EG Ⅲ表达带,能够产生CMC水解圈,说明eg3基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG Ⅲ的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG Ⅲ的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉eg3基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达.     

植酸酶在酿酒酵母细胞表面上的展示及其活性测定

提取黑曲霉总RNA反转录得到cDNA第一链,并以之为模板进行RT-PCR扩增出约1.4kb的植酸酶基因,双酶切插入用于酒精酵母表面展示的穿梭质粒载体pYD1,转化大肠杆菌DH5α,提取阳性质粒转化酒精酵母菌株EBY100,诱导表达后每隔12h测定植酸酶酶活,结果测得最佳诱导时间为48h.通过对表达产物的酶学性质研究,发现该表达产物在pH7.0时具有较高植酸酶活性,同时该表达产物的最适温度约为65℃.     

绿色木霉EG III基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

 通过RT PCR从绿色木霉AS33711中克隆得到EG III基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉 eg3 的同源性为99.6%。将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2489,通过SDS PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析。结果表明：转化子有明显的重组EG III表达带,能够产生CMC水解圈,说明 eg3 基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG III的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG III的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉 eg3 基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达。     

Egr-1基因反义干扰表达载体的构建与鉴定

为构建可在人肝癌细胞中稳定表达Egr-1基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,设计合成Egr-1基因shRNA片段,连接到经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pGreenPuro~(TM)shRNA真核表达载体中,连接产物转化大肠杆菌后挑取阳性菌落扩大培养,经菌液PCR法初步鉴定为pGreenPuro-Egr-1shRNA重组子的重组子DNA,用测序法进一步鉴定,结果显示成功构建了Egr-1基因shRNA的反义干扰表达载体pGreenPuro-Egr-1shRNA.     

绿色木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因的克隆及其在酿酒酵母中的高效表达

采用RT-PCR 的方法从目前最高效的纤维素酶产生菌之一的绿色木霉AS3.3711中克隆得到纤维二糖水解酶Ⅱ（CBHⅡ）的编码基因cbh2。序列测定和分析表明,该编码序列长1416 bp,编码472个氨基酸残基,与已公布的绿色木霉CICC 13038的cbh2仅在第263位存在一个氨基酸残基的差别（Gln替换为Pro）,而与里氏木霉VTT-D-80133的cbh2则完全同源。该序列已经提交GenBank,登录号为 DQ864992。利用信号肽预测软件SignalP 3.0发现该基因自身带有信号肽序列,其最大可能的切割位点在18和19位氨基酸残基之间。将该基因片段接入酿酒酵母高拷贝数整合型表达载体pScIKP中,得到重组表达质粒pScIKP-cbh2。经酶切线性化后电转化酿酒酵母AS2.489菌株,通过G418浓度梯度筛选出高抗转化子。转化子经蛋白电泳分析,发现该基因的信号肽序列能够被酿酒酵母识别,因此重组CBHⅡ成功分泌到了胞外。但可能由于酿酒酵母表达系统的过度糖基化作用,重组CBHⅡ比出发菌绿色木霉的CBHⅡ分子量要高许多,并且可能因为过度糖基化作用位点不同而形成了不同大小分子量的表达产物。转化子经CMC糖化力法测定酶活,发现该重组CBHⅡ酶活性并没有受过度糖基化作用的影响,最高可达7.71 U/mL,比大多数报道的要高。其作用的最适pH值为5.0,最适温度为65 ℃,且具有较好的热稳定性。     

地衣芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据已发表的Bacillus licheniformis植酸酶基因DNA序列(13eneBank AF469936),设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以地衣芽孢杆菌AB91062的总DNA为模板,扩增出了植酸酶基因phyL的编码区,并将其克隆到pMD18-T载体上,进行了序列测定,测序结果经Genetool序列分析表明该基因编码区长1146bp,编码381个氨基酸,与已发表的Bacillus lichenjformis植酸酶基因序列在核苷酸水平上与所发表的序列有92％的同源性;在氨基酸水平上与已发表的衣芽孢杆菌植酸酶相似性为93％．并将该基因编码区克隆到大肠杆菌表达质粒pHBM625上,并在大肠杆菌中实现了高效表达,表达产物具有正常的生物学活性．     

关于农业区划地图集中的统一协调问题

图集的统一协调,对图集质量有很大影响。本文是作者在编制北京市农业区划地图集的实践基础上,根据地图信息传输论的观点,对农业区划地图集的统一协调的内容及方法进行了探讨。试图总结编制这类图集的统一协调模式,以供读者编图时参考。     

民间法正义观的转型

研究了国家法的抽象正义观与民间法的情理正义观,认为西方国家法的抽象正义观与东方民间法的情理正义观存在实质的不同,原因在于思维方式、超验与经验传统、政治结构的差别。在现代法治理念下,传统民间法所代表的正义观将向混合正义观转型,西方法治所代表的国家法抽象正义观是其骨架。     

关于一维非自治时滞系统点态退化一例

给出了一维非自治时滞系统点态退化的一个例子,拓宽了该领域的研究。     

十二烷基苯硝化选择性的测定

利用对位异构体的对称性由核磁共振氢谱测定了工业十二烷基苯在硝硫混酸中的硝化选择性，发现一硝化产物中对位异构体的比例为７５％￣８０％。以月桂酸和苯为原料，经氯化、酰化和还原合成了正十二烷基苯。在同样条件下研究了正十二烷基苯的硝化，由核磁共振氢谱和气相色谱分析，发现一硝化产物中对位异构体的比例仅为６０％。根据空间位阻效应，对结果进行了讨论，并与甲苯，乙苯，异丙苯等短链烷基苯的硝化结果进行了比较。     

YBCO掺杂效应研究

介绍了YBCO掺杂的基础知识,总结了YBCO各个位置采用典型元素掺杂而导致的超导电性和结构的变化,阐述了掺杂对YBCO的重要影响,并简介了当前YBCO掺杂效应研究中的几个热点问题.     

A_5的一类12阶子群的构造

由于有限群的Lagrange定理的逆不成立,因此,n较大时要确定n次交代群An的所有子群或对An阶数的每一个正因数,确定是否存在这个阶数的子群是较困难的问题.文章通过对5-循环置换各次方幂的计算及其研究,构造出了A5的5个12阶子集,并证明了每一个子集都是A5的12阶子群,最后对A5的部分阶的子群做了总结.     

“真空的真空”的存在性问题

许多科学家包括诺贝尔奖获得者李政道教授都预言,真空是未来物理学的一个重要研究对象.十七世纪的伽利略时代人们曾讨论过"真空"是否存在的问题.当时的学术界分成两派,一派以帕斯卡为代表,认为真空存在,另一派以笛卡尔为代表,认为真空不存在,最后实验证明"真空存在派"正确.现代研究表明,真空并非一无所有,这样就产生了一个新的问题"排除了真空物质后的空间",即"真空的真空"是否存在.本文探讨了与"真真空"有关的问题,提出了一些观测实验方法,这些方法可以帮助我们最终解答"真真空"的存在性问题.     

高频机组基础振动检测分析

为了找出诱发高频机组基础不良振动的原因，从基础计算模型方面对基础激励与响应进行了分析，以两个高频机组基础为动测实例，经模态分析得出钢筋混凝土构架式基础竖向1阶振动与电机产生共振；应用功率谱法对动力机组及基础平台进行动测，得出平台异常响应频率66Hz为水泵工作频率，调整机器的工作频率可避开不良振源影响，达到明显的减振效果。由此而知，动力机器基础出现不良振动时，不可盲目改变结构的动力特性，应在机器不同工况比如：停机、起机及正常转速下，对机器及基础进行动测并对振动信号进行比较分析，以制定出行之有效的减振方法。     

圈幂补图的树宽

基于“前沿分支”的观点研究了圈幂补图的树宽，首先确定了它的树宽下界，又给出了达到此下界的标号，从而得到了它的树宽表达式。