中国登革2型病毒反向遗传系统的构建与鉴定

为构建登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的反向遗传系统, 根据已测定的DEN2-43全基因组序列, 利用长链RT-PCR及融合PCR扩增此病毒基因组全长cDNA分子, 并将其克隆至低拷贝载体pWSK29中构建该病毒株的全长cDNA克隆. 将此克隆体外转录后, 经电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒. 结果表明, 获得的基因组全长cDNA克隆具有感染性, 所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及乳鼠神经毒力, 且可稳定传代. 该反向遗传系统的构建为深入探讨登革病毒的致病机理及新型疫苗的研制奠定了基础.     

构建猪瘟病毒致细胞病变的PK-15细胞模型

猪瘟病毒在离体细胞培养条件下不引起宿主细胞病变, 病毒与宿主细胞之间相互作用的研究一直没有合适的模型. 以猪瘟病毒中国标准强毒石门株为材料, 通过基因工程的手段, 在构建全基因组感染性克隆的基础上, 对全基因组进行部分缺失, 获得了7.5 kb的亚基因组, 以携带野生型猪瘟病毒的PK-15细胞为宿主, 用亚基因组进行转染, 得到了能够诱导PK-15细胞产生CPE的亚基因组病毒, 检测显示产生CPE的细胞培养物中野生型基因组和亚基因组共同存在. 猪瘟病毒致细胞病变模型的构建, 为进一步研究其致病的分子机制开辟了新的方向.     

带有REV-LTR片段的MDV野毒株GX0101 BAC克隆的构建及拯救病毒的致病性分析

将整合有禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis, REV)长末端重复序列(LTR)的马立克氏病病毒(命名为GX0101)全基因组作为细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)克隆进大肠杆菌. BAC载体通过同源重组插入MDV基因组的US2区, 含BAC载体的MDV DNA电转化大肠杆菌菌株DH10B, 鉴定含MDV全基因组的BAC克隆(MDV BAC), 提取BAC DNA, 转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF), 成功拯救出了重组病毒, 命名为bac-GX0101. 将此病毒腹腔接种1日龄鸡, 在攻毒后62 d开始检测到内脏肿瘤, 动物实验结果表明, bac-GX0101毒株与亲本GX0101毒株对机体的致病性等方面的影响没有差异, bac-GX0101毒株仍然保留着很好的免疫抑制功能及致肿瘤能力. 该感染性克隆bac-GX0101为研究该重组野毒株中REV-LTR插入片段及其他基因的生物学功能提供了有用的技术平台.     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒全长可读框的表达及其产物免疫原性分析

将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)全长约为6.9 kb的可读框(ORF)克隆到家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中, 构建重组家蚕杆状病毒转移质粒pVL-ORF. pVL-ORF与线性化的亲本病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞, 经空斑筛选后成功获得携带有FMDV全长ORF的重组病毒Bm-ORF. 免疫荧光技术证明, 重组病毒能够正确表达插入的外源基因. 将获得的重组病毒Bm-ORF感染家蚕5龄起幼虫, 双抗体夹心ELISA法和电子显微镜观察证明, 目的基因在蚕体中获得较高水平表达并组装成空衣壳. 用蚕表达产物作抗原制备疫苗免疫牛, 免疫动物均产生了特异性抗体. 免疫后21 d进行病毒攻击保护实验, 获得了2/4的完全保护.     

由标准强毒F114株全长cDNA克隆恢复猪瘟病毒

通过RT-PCR获得猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)强毒株cF114株(中国标准强毒F114株经PK-15细胞增殖)全长基因组cDNA并测序. 与已知其他几株CSFV代表毒株F114, Brescia, Alfort和C株的核苷酸同源性分别为99.41%, 96.80%, 86.03%和95.70%; 氨基酸同源性分别为99.28%, 98.54%, 93.33%和97.41%. 将获得的各基因片段按病毒基因组顺序连接成全长cDNA, 插入pMC18质粒SalⅠ/ XbaⅠ之间, 得到含病毒全长基因组的重组质粒pMC12297. 用T7 RNA聚合酶进行体外转录, 转录出的RNA转染PK-15细胞, 细胞上清液经扩增后, 测定上清液中病毒滴度. 质粒来源的CSFV(vM12297)在抗原反应性和复制能力方面与父代病毒相似. 将疫苗毒C株囊膜蛋白基因E01和E2分别替换到pMC12297相应位置, 获得嵌合体基因组质粒pM/CE01和pM/CE2, 体外恢复获得嵌合体病毒vM/CE01和vM/CE2. 两种嵌合体病毒均能感染PK-15, SK-6和原代猪睾丸细胞, 间接免疫荧光检测显示较vM12297弱, 在PK-15细胞上滴度达到8×10 F-PFU/mL. 这一工作为进一步研究和探讨CSFV增殖与致弱的机理提供了重要的实验和理论资料.     

共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性

将FMDV衣壳蛋白P1-2A和蛋白酶3C基因单一/共同插入到鸡痘病毒载体pUTA-2和pUTA- 16LacZ中, 构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2P1和pUTAL3CP1, 分别与鸡痘病毒282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞, 经RT-PCR, IFA及Western杂交等方法筛选后成功获得携带有FMDV免疫原基因的两株重组鸡痘病毒株vUTA2P1和vUTAL3CP1. 应用2株重组鸡痘病毒株免疫小鼠, 经对免疫小鼠脾细胞中T细胞亚类计数、脾细胞CTL杀伤活性以及FMDV抗体的检测, 证明这2株重组鸡痘病毒可以诱导小鼠产生明显的细胞免疫和体液免疫反应. 以鸡痘病毒为载体进行FMD基因工程活载体疫苗的研究为FMD的最终防治探索一种新的候选疫苗.     

新型杆状病毒穿梭载体及绿色荧光蛋白在棉铃虫中的表达

利用棉铃虫核型多角体病毒的全基因组ＤＮＡ构建转座－穿梭载体Ｈａｎｐｖｉｄ,它既能在大肠杆菌中以质粒的形式复制,又能在棉铃虫细胞中复制形成感染性病毒粒子。Ｈａｎｐｖｉｄ携带转座－穿梭盒,包括原核复制子ｍｉｎｉＦ,卡那霉素抗性基因Ｋａｎ,ＬａｃＺα和Ｔｎ７转座子的接受位点ａｔｔＴｎ７。另一供体质粒以转座的方式将绿色荧光蛋白基因和经亚克隆的多角体蛋白基因整合到Ｈａｎｐｖｉｄ的ａｔｔＴｎ７位点上成为重组病     

传染性法氏囊病毒HZ2株VP5基因缺失株的构建

通过PCR方法, 删除传染性法氏囊病毒HZ2株ORF A1和 ORF A2非重叠区的33 bp (96~129 bp)的同时, 引入NheⅠ酶切位点(GcTaGc)作为分子标记, 构建含有A节段突变体的真核表达载体pCI-Nhe3, 与HZ2株B节段真核表达载体pCI-mB在脂质体介导下共转染鸡胚成纤维(CEF)细胞. 用转染细胞的培养液上清不断地接种新鲜细胞, 模拟病毒“传代”. 结果表明, 细胞的形态学特征发生变化, 产生了类似野生IBDV感染细胞时出现的细胞病变效应(CPE). 电子显微镜观察显示, 在细胞超薄切片中有IBDV病毒粒子. 间接免疫荧光分析结果表明, 拯救的ANhe3株病毒的结构蛋白在CEF细胞得到了表达, 而非结构蛋白(VP5)则不能表达. 针对A节段的RT-PCR, 酶切鉴定及进一步的序列测定结果验证了相应核苷酸片段的缺失和分子标记的引入. ANhe3株病毒接种不能导致11日龄SPF鸡胚的死亡, 相对HZ2株致死率(20%)明显下降. 本研究利用基于cDNA转染和RNA聚合酶Ⅱ系统的IBDV反向遗传系统, 构建了IBDV VP5基因大片段缺失的毒株ANhe3株, 为IBDV基因组学的研究提供了新方向, 为进一步探索病毒复制和致病机制以及开发基因缺失疫苗奠定基础.     

以EBV复制子载体为基础的新型重组AAV载体包装系统

重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体是能建立稳定表达的转导型表达载体,可用作基因治疗的外源基因荷载工具.与逆转录病毒相比,它具有高安全性、无致病性和能感染有丝分裂后细胞等的特点.目前重组AAV的制备,需要两种不同的重组AAV质粒,一种是含位于AAV基因组两端的为病毒复制和包装所必需的反向末端重复(Inverted ter-minal repeats,ITR)和外源基因的重组表达质粒载体;另一种质粒作为助手质粒,克隆了除两端ITR外的AAV全基因组DNA,它反式提供AAV复制和包装所需的病毒蛋白,当这两种质粒共转染宿主细胞时,如存在辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)的感染,就能包装出含外源基因的重组AAV假病毒颗粒.     

meq与lorf9双基因缺失显著降低超强马立克氏病病毒的复制能力

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus, MDV)感染引起以鸡体严重免疫抑制和内脏肿瘤为主要特征的马立克氏病(Marek’s disease, MD). MDV的感染过程分为早期溶细胞感染、潜伏感染、肿瘤转化和再次激活感染4个阶段.为了研究构建的meq与lorf9双基因缺失重组毒株在宿主体内的复制特性,应用实时荧光定量PCR技术(Realtime PCR)对MDV感染后第6, 14日龄鸡脾脏中的病毒拷贝数进行检测,结果表明,双基因缺失病毒在早期溶细胞感染和潜伏感染期中的复制显著降低;对MDV感染后第63日龄鸡的脾脏和羽毛囊中的病毒拷贝数进行定量分析,结果表明meq与lorf9双基因缺失也显著降低了病毒在肿瘤转化期和再次激活阶段的感染拷贝数.本研究为进一步探讨meq与lorf9双基因缺失在MDV致病和免疫机制中的作用提供了理论基础.     

棉属D基因组棉种着丝粒FISH标记的筛选初报

为了筛选着丝粒探针, 在棉花染色体荧光原位杂交中标记染色体着丝粒区域, 以便于构建棉花粗线期染色体细胞遗传学图谱. 在棉花遗传连锁图上选择尽可能接近着丝粒区的单拷贝的分子标记, 以海岛棉pima 90-53的BAC文库为素材, 采用两维筛库法从该文库中筛选BAC克隆, 然后用BAC-FISH技术进行染色体定位检测. 用10号染色体长臂末端的SSR引物BNL3563筛选到一个BAC克隆150D24, 该克隆在四倍体陆地棉和海岛棉部分染色体着丝粒区有杂交信号, 但信号强度不高. 以二倍体D基因组为靶DNA进行FISH时, 染色体着丝粒区有明显信号, 但是以二倍体A, C, E等基因组棉种染色体为靶DNA进行FISH时, 染色体着丝粒区未发现杂交信号. BAC克隆150D24可能含有D组特有卫星重复序列, 可用作棉属D基因组棉种(包括四倍体棉种D亚组)的着丝粒FISH探针.     

RDD基序对口蹄疫Asia1型毒株感染力的影响

不同型口蹄疫病毒1D蛋白的βG和βH链之间都含有一个高度保守的RGD基序,其结合细胞受体,起始病毒感染.但本文通过对Asia1型FMDV的1D序列分析证实,田间毒株含有RGD和RDD基序(RGD中的G突变为D)的两种类型毒株.通过反向遗传技术制备了分别含有RGD和RDD基序的两种病毒,测定其生物学特性,并通过细胞感染力和乳鼠致病力比较这两种病毒感染力的差别.结果表明,含有RGD和RDD的毒株都具有感染性,含有RDD毒株的细胞感染力和乳鼠致病力比含RGD的高10倍左右,为进一步阐明RDD基序Asia1毒株的感染机制的分子基础奠定必要的基础.     

后基因组时代十年志——兼论十年间生命科学的发展及所面临的挑战

   十年前,“人类基因组计划”这一耗资30亿美元、耗时十余年的伟大科学工程完成之际,人们以为得到了揭开自身生命奥秘的天书,生命科学也划时代地进入了后基因组时代。十年间,一方面,人类基因组的后续工作陆续展开,生命科学持续蓬勃发展的态势;另一方面,基因药物却迟迟不能问世,基因产业逐渐沦为泡沫经济。2010年恰逢人类基因组草图完成10周年,回顾十年间生命科学取得的伟大成就,分析生命科学当下面临的挑战,或许更能理清后基因组时代现代生命科学的发展脉络与走势。     

非对称直齿圆锥齿轮的建模及其接触应力的有限元分析

在PKO／E中运用齿轮精确建模的方法生成一对啮合直齿圆锥齿轮。然后将模型导入MSC．Marc,并对直齿锥齿轮的接触过程进行三雏弹性有限元模拟,进而分析了节点处的接触应力,并与赫兹接触应力理论值进行比较,结果理想,从而实现了CAD与CAE的一体化。     

乳腺癌特异性多肽介导生物大分子体内外效应

探讨乳腺癌特异性多肽PI携带外源性生物大分子靶向抗肿瘤的作用.将分离纯化获得的融合蛋白PI-EGFP与靶细胞MDA-MB-231体外共培养,探讨融合蛋白与靶细胞的结合能力;将此融合蛋白经尾静脉及肿瘤局部注射入荷瘤裸鼠体内,探讨其在肿瘤部位的聚集程度;利用分子克隆技术构建重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk,诱导表达、分离纯化、鉴定获得的融合蛋白PI-HSV-TK,将不同浓度的融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,经更昔洛韦(ganciclovir,GCV)作用后,探讨PI-HSV-tk对细胞的靶向杀伤效应.荧光显微镜下观察,在靶细胞内可检测到绿色荧光信号,经尾静脉及局部注射融合蛋白PI-EGFP后,在不同组织器官可见不同强度的荧光信号,在尾静脉注射组的肾脏和肿瘤部位可检测到荧光信号,而局部注射组仅在肿瘤部位可检测到;成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk;分离纯化获得高效表达的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定融合蛋白的表达正确;CCK-8法及流式细胞仪检测显示,GCV对转导融合蛋白的MDA-MB-231细胞有杀伤作用,IC50值为152.64μg/mL.乳腺癌特异性转导多肽能携带生物大分子进入靶细胞,并携带具有杀伤效应的物质,使其发挥靶向治疗作用,为进一步探讨该多肽作为靶向性载体奠定实验基础和理论依据.     

嫦娥一号的奔月日记

北京时间2007年10月24日18时05分，长征三号甲火箭托举着我国第一颗月球探测卫星——嫦娥一号在西昌卫星发射中心，从三号甲塔架点火发射。11月5日上午11时，嫦娥一号顺利被月球“捕获”成为一颗绕月卫星。在经过三次近月制动后，嫦娥一号进入开展科学探测的工程轨道，随后将进行为期一年的对越科学探测。这是探月三部曲的第一步，也是中国空间探测历史上的新的里程碑。本文介绍了嫦娥一号从发射到2007年11月26日的每一次重要事件。     

云南陆稻品种籼粳分化与遗传变异

利用34个籼粳特异插入缺失(insertion/deletion,InDel)分子标记和24个SSR分子标记对云南113个陆稻品种的籼粳分化与遗传变异进行分析.InDel分子标记鉴定结果表明,云南陆稻以粳稻(粳型、偏粳型)品种为主,占总品种的83.2%.聚类结果显示,云南陆稻品种明显聚为4大类群(籼型、偏籼型、粳型、偏粳型),支持InDel分子标记鉴定结果.重新将云南陆稻品种的种植区域划分为2个:(1)海拔1250m以下为籼粳稻混合种植区;(2)海拔1250m以上为粳稻种植区.SSR遗传多样性分析结果表明,云南陆稻籼粳亚种间遗传多样性均很丰富,籼稻品种的遗传多样性高于粳稻品种且差异显著.分子方差分析显示,云南陆稻遗传变异主要来自亚种内(占总变异81%),亚种间遗传变异占19%.不同地区间陆稻种质资源遗传多样性比较分析表明,滇西南与滇南地区存在丰富的遗传变异,是云南陆稻品种遗传多样性的分布中心.半山云雾多湿区作为云南陆稻品种的传统种植区域,保留大量的遗传变异与稻种资源,是开展陆稻种质资源保护、利用的核心区域.     

S-DABO类非核苷类HIV-1逆转录抑制剂HQSAR

采用分子全息定量构效关系(HQSAR)方法, 研究了34个HIV-1逆转录酶抑制剂S-DABOs类化合物的结构与活性之间的关系. 讨论了分子碎片大小、碎片区分参数以及分子全息长度对模型的影响. 以26个化合物构成的训练集所建最优模型的交叉验证相关系数q²为0.755, 相关系数r² 为0.949. 对8个化合物构成的测试集进行了预测, 其预测相关系数r_pred²为0.95, 表明所建模型不仅有较高的拟合能力, 还有良好的预测能力. 最后, 利用HQSAR模型的色码表示, 探讨了对S-DABOs类似物的活性起重要作用的结构与片段, 为此类化合物的进一步结构改造与优化提供理论指导.     

一种新型羟基自由基产生分子机理的研究

羟基自由基(·OH)被公认是生物系统中最具活性的活性氧物种,能导致生物体内DNA,蛋白质和脂质氧化损伤.目前,关于·OH的产生机理,最被广泛接受的是过渡金属离子催化的Fenton反应.五氯酚(PCP)是一种重要的工农业生物杀灭剂,主要用作木材保护.采用水杨酸羟基化法和电子自旋共振自旋捕获等作为分析手段,发现H2O2和五氯酚的代谢产物之一四氯-1,4-苯醌(TCBQ)能通过不依赖于金属离子的途径产生·OH;进一步的研究发现,TCBQ而非其相应的半醌自由基对·OH的产生极其重要.TCBQ和H2O2反应的主要产物被鉴定为三氯羟基-1,4-苯醌(TrCBQ-OH),其中的氧原子被证明来源于H2O2.基于这些数据和分析,提出以下假设:TCBQ和H2O2反应产生·OH不是通过依赖于半醌自由基的有机Fenton反应进行,而是H2O2对TCBQ进行亲核攻击,形成不稳定的三氯氢过氧基-1,4-苯醌(TrCBQ-OOH)中间产物,其可均裂产生·OH和三氯羟基-1,4-苯醌自由基(TrCBQ-O·).上述反应途径展示了一类新型的·OH产生机理,即·OH的形成不需要具有氧化还原活性的过渡金属离子参与.该机理可部分解释五氯酚等其他多卤...