用生物信息学方法发现跨染色体剪接的嵌合5''''/3''''UTRs

mRNA的5/3UTRs是在mRNA翻译过程中起重要调控作用的序列,在5/3UTRs上不正常的剪接模式可能导致多种严重疾病.提出了一种基于大规模序列比对分析搜寻5/3UTRs跨染色体剪接现象的方法,并用此方法得到8例可信度高的跨染色体的5/3UTRs剪接事件,从信息的角度证实了来自不同染色体序列剪接成为5/3UTRs的现象是真实存在的.对这8例跨染色体剪接产生的5/3UTRs用多序列比对在剪接区域没有发现一致保守的motif.同时,目前的预测算法也不能在剪接区域检测到特异性的RNA二级结构,因此很难确定引导5/3UTRs跨染色体剪接的信号.     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)mRNA5′端非翻译区(UTR)对其表达的调控

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在人体纤溶与凝血的平衡调控中发挥重要作用,而且在治疗心血管栓塞性疾病方面具有广阔的应用前景.t-PA在人体内的表达受严格调控,其mRNA具有较长的非翻译区序列.我们曾报道了t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的调控,为研究长约209nt的5′-UTR序列对t-PA表达的影响.本文采用反转录-PCR技术从黑色素瘤细胞中克隆出t-PA cDNA 5′端序列,在体外和体内2个系统中研究了5-′UTR序列对t-PA表达的影响.     

我国科学家发现基因剪接调控新机制

正mRNA选择性剪接是真核生物中基因表达的一种高效、精准的调控机制,它是指剪接体通过在mRNA前体上的识别定位,准确地切除内含子序列,将不同的外显子序列拼接到一起,产生不同的成熟mRNA转录本.选择性剪接是形成结构和功能多样的蛋白质的重要物质基础,至少90%的人类基因都存在选择性剪接,在细胞生长和组织分化等方面发挥关键作用.选择性剪接产物的自然平衡是维     

信使RNA前体的剪接反应:分枝点和套环状RNA

mRNA前体的剪接反应涉及一种异常的RNA结构:一种套环状或尾环状分子,其中插入序列的5′端同链内某一核苷酸之间借2′—5′磷酸二酯键连接在一起。本文对套环状结构的形成及其可能的意义进行了讨论。     

反义核酸对β-地中海贫血基因(IVS-2-654 C→T)剪接缺陷抑制作用的研究

β-珠蛋白基因第2个内含子(IVS-2)中第654位核苷酸(nt654)C→T剪接缺陷型突变是中国人最常见的β-地中海贫血(简称β-地贫)突变类型之一.我们先前的研究表明,该突变在IVS-2第654位(nt654)上出现的单碱基取代产生了一个新的 GT二核苷酸,它联同旁侧序列构成了一个5＇异常剪接位点,同时还激活了IVS-2第579位(nt579)处3＇隐匿剪接位点,从而将 IVS-2nt580至 nt652之间一段73bp内含子序列作为额外的外显子插入外显子2和外显子3之间,产生了异常的β-珠蛋白mRNA,导致β~ -地贫.为了探讨反义核酸治疗β-地贫IVS-2-654 C→T突变的可能性,我们应用体外转录和体外剪接系统,以体外转录产生的特异反义RNA封闭IVS-2-654 C→T突变基因中3＇隐匿剪接位点和5＇异常剪接位点,使之失去活性,从而减少异常加工的mRNA并且部分恢复了正常剪接途径.     

黄色黏细菌fruA mRNA 5′非翻译区正性调节其自身基因的表达

黏细菌是研究多细胞结构形态发生机制的良好模型. FruA是黏细菌发育所必需的一种转录因子, 其mRNA 5′端存在相当长的由235个核苷酸组成的非翻译区（5′-UTR）. 以lacZ为报告基因,构建保留或缺失5′-UTR的fruA-lacZ翻译融合载体并在染色体attB位点定点整合. 5′-UTR自+4至+220缺失后fruA-lacZ在发育阶段几乎不表达, 说明完整的5-′UTR为fruA表达所必需. 二级结构预测显示该区域可形成高度稳定的3螺旋接合结构, 可能是蛋白因子的结合位点或存在调节fruA表达的顺式元件. 因此fruA发育特异性表达受其5′-UTR的正性调控.     

一个新的人类硫氧化还原蛋白基因的克隆

根据不同发育阶段 ( 1 3,33周 )的人胎脑组织mRNA差异显示分析 (又称DDRT PCR)所得到的具有差异表达的EST的序列 ,设计引物筛选点阵排列的人胎脑cDNA文库 ,得到一个新的全长cDNA克隆 .这个克隆全长 1 2 0 8bp ,包含一个 889bp的开放阅读框 ,一个 1 32bp的 5′非翻译序列和一个 2 0 9bp的 3′非翻译序列以及典型的polyA加尾信号 .其推断的氨基酸序列与人硫氧化还原蛋白同源 ,而且含有硫氧化还原蛋白的保守的活性位点序列 .将它命名为人的类硫氧化还原蛋白基因 (humanthioredoxinlikegene ,hTRXL) .     

水稻mRNA多聚腺苷化信号位点的序列分析

大部分真核生物mRNA的加工涉及到mRNA前体的分裂/多聚腺苷化, 在3′-末端形成多聚腺苷酸(poly(A))尾巴. 为了研究水稻mRNA前体多聚腺苷化过程所必需的poly(A)加尾信号、下游调控元件和poly(A)位点等序列的特点, 用3′-末端带有poly(A) 的EST与全长cDNA序列进行比较, 建立了一个来自9953个基因的、覆盖12969条poly(A)位点两侧各40碱基序列的数据库. 结果发现, 只有7.9%的mRNA使用AAUAAA作为加尾信号, 超过60%使用AAUAAA的1~2个碱基变化的序列作为加尾信号, 11.5%的mRNA使用AAUGAA及其单碱基变化的加尾信号. 在约25%的mRNA的3′-末端存在多个poly(A)位点. 在90%的mRNA前体的加尾信号下游都能检测到富含U/GU的调控元件, 尤其在以AAUAAA的多碱基变化序列作为加尾信号的mRNA前体中, 半数以上都能在poly(A)位点两侧检测到下游调控元件. 而且, 这些调控元件的位置对poly(A)位点的选择有限制作用. 总之, 虽然水稻mRNA加尾信号的保守性较低, 但大量下游调控元件的存在保证了多聚腺苷化过程的正常进行.     

玉米、二倍体多年生类玉米及其杂交后代异染色质纽重复序列在染色体上的分布

利用组成玉米异染色质纽的180-bp重复序列和TR-1元件以及45S rDNA对二倍体多年生类玉米(Zea diploperennis Iltis Doebtey, DP)、玉米自交系F102及其远缘杂交后代的有丝分裂中期染色体进行了定位. 在DP中, 第1和4染色体的短臂以及第4和5染色体的长臂上的异染色质纽只有180-bp重复序列信号, 此外, 在第2和5染色体的短臂以及第2, 6, 7, 8和9染色体的长臂同时检测到180-bp重复序列和TR-1的信号. 在玉米自交系F102中, 180-bp重复序列信号出现在第7染色体短臂和第8染色体一个成员的长臂, TR-1信号是在第6染色体的随体上, 该玉米自交系中没有观察到双重复序列同时出现的现象. 两物种间, 180-bp重复序列和TR-1元件信号大小、数目和染色体分布存在多态性, 同一种内部分同源染色体之间具有异态性. 以这些细胞学标记为探针, 玉米和DP种间杂交后代得以鉴定. 180-bp重复序列和TR-1元件比较定位分析有助于了解玉米属基因组间的结构和进化关系.     

2个水稻端粒相关序列的克隆和特性分析

端粒,位于真核生物染色体端部,是DNA和蛋白的复合物,对染色体的复制和稳定起着重要作用.端粒DNA由短重复序列组成,大多数高等植物,这一序列是5′TTTAGGG.相邻于端粒重复序列的是端粒相关序列,往往由中等重复序列组成.与端粒比较,端粒相关序列的显著特点是它的高度多态性,不同物种,甚至同一亚种内不同植物都能给出很高的多态性.因此在基因组RFLP框架图和物理图谱的构建中,端粒相关序列的克隆和分析有重要意义.本文根据水稻端粒重复序列中无限制性内切酶位点,端粒相关序列中可能有内切酶位点     

水稻RAD21同源基因(OsRIX4)存在多种mRNA选择性剪接模式

稻RAD21同源基因(OsRIX4)存在着多种mRNA选择性剪接模式, 从中鉴定出一类特殊的剪接模式, 即一个组成型外显子内部的部分片段可以被单独剪除, 该类型不属于已知的5类剪接模式之一.这种剪接模式所产生的转录本能够独立地得到翻译. OsRIX4基因多转录本的表达各具组织特异性, 其中OsRIX4-4和OsRIX4-5转录本的表达量与水稻育性呈正相关. 这种剪接模式的发现, 可以为理解和定义植物mRNA剪接模式提供新的内容, 也凸显转录后mRNA加工和调控机制的复杂性.     

β-珠蛋白基因——至少有两个插入DNA

关于β—珠蛋白mRNA的结构,已经了解得相当详细,如已知其5′端有甲基化的封闭结构,3′端有多聚A,还知道翻译部分的核苷酸序列与氨基酸序列相互对应等。与此相反,关于β-珠蛋白基因的结构及存在方式却了解得极少。但自从蒂尔门(Tilghman)等人对鼠β-珠蛋白基因进行无性繁殖以来,这方面的研究取得了迅速的进展。他们首先揭示出β-珠蛋白基因的核苷酸序列与成熟mRNA的核苷酸序列不完全对应,证明基因内至少有两个插入DNA。     

一个编码玉米转译起始因子新基因的克隆

采用DD PCR方法比较玉米杂种一代及其亲本苗期基因表达产物mRNA的差异 ,分离并鉴定出一个玉米杂种一代超亲表达的cDNA .以该cDNA为探针从cDNA文库中筛选到一个全长的cDNA克隆 (ZH0 1) .ZH0 1长 1780bp ,5′端非编码区 112bp ,3′端非编码区 395bp ,开放阅读框共编码 4 14个氨基酸 .序列同源比较表明 ,ZH0 1为一个亲的玉米转译起始因子eIF4A基因家族成员 .     

基于剪接信号和调节元件序列特征的剪接位点预测方法

结合剪接相关的剪接信号和调节元件的序列特征信息, 发展高效的剪接位点预测方法, 是真核生物基因预测中一个新课题. 运用熵密度分布(EDP)距离方法、权重数组法(WAM)、κ检验等算法建立了剪接位点相关的剪接信号的统计模型, 同时基于无监督自学习的基序检测方法建立了调节元件的统计模型, 在此基础上设计了基于多层次支持向量机(SVM)的剪接位点预测新算法, 实现了真核基因剪接位点的从头(ab initio)预测. 对人类基因组剪接位点数据的大规模测试结果表明, 本研究提出的方法能够有效地预测人类基因组中的剪接位点, 预测水平不仅全面高于传统的基于剪接信号的预测方法GeneSplicer, 而且在总体预测精度上达到并大部分超过基于调节元件信号的预测方法SpliceScan. 对于低GC含量的基因序列, 本文方法的预测精度明显地高于其他两种方法.     

猪瘟病毒石门株全基因组cDNA文库构建、序列测定及分析

根据已发表的猪瘟病毒序列 ,设计并合成了 1 8对覆盖全长基因组的引物 .应用RT PCR技术从猪瘟病毒石门株感染的猪血中扩增出各相应的cDNA片段 ,分别克隆 ,构建了石门株全基因组的cDNA文库并完成了序列测定 .石门株基因组全长 1 2 2 98nt,其中 5′端和 3′端非编码区长度分别为 373和 2 31nt,中间一个大的开放阅读框长 1 1 6 97nt,翻译成一个包含3898个氨基酸残基的多聚蛋白 .还对石门株序列与其他猪瘟病毒序列进行了分析比较     

EXO70在拟南芥和水稻基因组中的倍增

作为胞泌复合体的一个重要组件,EXO70在人类、小鼠及酵母中均由单基因编码.为研究EXO70在拟南芥和水稻基因组中倍增的异同,从拟南芥和水稻基因组中钓取所有的EXO70家族基因,分析后发现,拟南芥中包含23个EXO70基因,其中15个基因位于染色体的负链;选择性剪接的存在共产生27种成熟的m RNA.水稻中共发现47个EXO70基因座,它们分别分散于12条染色体的正负链,其中的29个基因位于正链;分别包含Os EXO70H3和Os EXO70H4在内的11号染色体和12染色体的5′端存在一段约2×106 bp区段的序列高度同源;Os EXO70基因倍增的复杂性高于拟南芥EXO70.EXO70基因在拟南芥和水稻中均存在密码子使用偏好性,At EXO70和Os EXO70的密码子偏好性存在较大的差异.Pfam03081是EXO70蛋白质共有的结构域,且在三维结构上极为保守,这可能决定不同的EXO70蛋白存在相同或相近的功能.结果表明,EXO70在拟南芥和水稻2个物种进化中均存在多次加倍,Os EXO70倍增的次数、方式和复杂性都高于At EXO70;高度保守的Pfam03081可能是决定EXO70蛋白功能的关键因素;像其他基因一样,EXO70同义密码子的偏性模式存在明显的物种特异性.     

葡萄与柴胡科间体细胞杂交再生杂种植株

狭叶柴胡原生质体用强度为 2 6 0 μW/cm2 紫外线照射 0 ,1 ,2和 3min后 ,与酿酒葡萄原生质体融合 .对融合再生的 1 9个单细胞克隆进行表型、同工酶、染色体和 5SrDNA间隔序列分析 .结果表明 ,它们均为体细胞杂种 . 1 1个杂种愈伤组织包括对称及不对称融合产物 ,在培养 5个月时 ,再生了体细胞胚、幼叶及叶丛 ;其中有 4个不对称融合的杂种细胞系在培养8～ 1 0个月后 ,再生出有根的完整小植株 .染色体观察表明 ,完整植株的再生与杂种细胞的染色体数目相对减少相关 .对部分小植株幼叶的核糖体 5SrDNA间隔序列差异的分析 ,证实它们为科间体细胞杂种 .     

山羊β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动区5′端上游调控序列和外显子1, 2及内含子1在内的乳腺表达载体, 并与人血清白蛋白(hALB)小基因(含全长cDNA序列及其内含子1)构建成融合基因. 鼠尾静脉注射实验表明, 该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达. 应用显微注射方法将该融合基因导入小鼠受精卵, 并将受精卵移植于假孕母鼠, 共获得33只F0代小鼠, 经PCR和Southern印迹杂交证实, 有8只小鼠(5♀, 3 ♂ )基因组中整合有hALB基因, 整合率为24.2%(8/33). Western blot分析表明, 在5只雌性整合小鼠中有3只表达了hALB蛋白, 放射免疫法测定其乳汁中hALB含量分别为3.54, 0.21和3.03 g/L.     

苜蓿膜联蛋白MtAnn3基因的鉴定及其在根毛发育中的功能

通过5′RACE扩增了苜蓿膜联蛋白MtAnn3基因cDNA的5′末端序列.典型的膜联蛋白由一个N端结构域和一个C端保守的核心结构域组成,核心结构域一般含有4或8个由70个氨基酸组成的重复单元,而MtAnn3蛋白的核心结构域仅有1个重复单元.在洋葱表皮细胞中瞬时表达MtAnn3蛋白,揭示其具有细胞膜结合的特性.借助农杆菌介导的苜蓿转化实验表明,过表达MtAnn3的根部在不含Ca2+的培养基上生长,改变了根毛的极性,根毛顶端膨大变形,有时出现分叉现象.在农杆菌介导的MtAnn3启动子-GUS实验中,外源植物细胞分裂素可以诱导MtAnn3启动子的增强表达;接种苜蓿中华根瘤菌进行结瘤实验,启动子在根瘤原基和幼嫩根瘤中有较强的活性,而在成熟根瘤中活性较低,在衰老的根瘤中检测不到启动子活性.虽然MtAnn3在根瘤中的表达具有一定的时序性,它却不是瘤特异性的,它在苜蓿的根、茎、叶中都有高水平的转录表达.     

X染色体的一个新的STS的创建

构建人基因组分辨率为100kb的STS(Sequene tagged sites)是今后5年的目标之一,为此需要创建3万个STS.1989年Olson等人首次提出STS图谱分析的概念,认为STS图谱可以作为染色体的骨架图(framework map)的位标(landmark).STS是人基因组中长为数百bp的单拷贝序列,它们的核苷酸顺序是已知的,在染色体上的位置已确定,并可以用PCR方法在基因组其它序列存在的情况下进行检测.