氮磷铁营养浓度对不同品系三角褐指藻生长影响的比较研究

三角褐指藻是海水养殖动物幼体较为理想的活饵料,已在水产育苗生产中得到了广泛应用。国内外学者对三角褐指藻培养液的营养组成进行过不少研究,但所得结论差异较大 [1, 2, 3]。但对不同品系的研究较少,只有 Hayward(1968)[6]研究了不同品系三角褐指藻的营养盐组成差异。为探明两种新分离品系三角褐指藻人工培养的营养需求,我们用正交试验比较了不同氮磷铁营养盐对不同品系三角褐指藻生长的影响,以期更好地为水产养殖服务。 1材料与方法 1.1试验材料 　　藻种：厦门海区三角褐指藻单种培养品系（ XS003）,浙江海区三角褐指藻单种品系…     

乙酸乙酯对三角褐指藻生长的影响

以三角褐指藻为研究对象,研究了不同质量浓度的乙酸乙酯对其生长的影响。结果表明,在质量浓度低于1.8g/L时,乙酸乙酯对三角褐指藻的生长不产生负面影响,并能提高三角褐指藻的细胞密度和部分脂肪酸的质量分数。其中,细胞密度提高了35%,C18∶0、C18∶2和C20∶5等几种具有经济价值的脂肪酸在总脂肪酸中所占的质量分数分别提高了15.32%,23.15%和31.13%。另外,光合作用活性测定结果表明,加入乙酸乙酯后,三角褐指藻的最大光合作用速率P_max降低、呼吸作用速率R_d增加,这证明了乙酸乙酯是以有机碳源的形式被藻细胞利用,三角褐指藻以混合营养的方式生长。     

三角褐指藻的培养条件研究

对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)进行了培 养条件研究,结果表明,在20 ℃下,采用去除氮源的No.4基本培养液,起始pH值为8.0,(N H2)2CO为氮源,氮浓度为0.01 mol/ L时,对藻细胞的光合自养生长极为有利,培养10 d,其生物量达441 mg/L.过高的碳酸氢钠 浓度(>0.04 mol/L)易引起培养液pH值的过大改变而导致培养液中出现沉淀,在培养液中加 入葡萄糖有利于藻细胞的生长,光合自养生长生物量浓度较低,混合营养明显促进藻细胞的 生长,且培养液中同时含质量分数0.2%葡萄糖和0.04 mol/L碳酸氢钠后藻生物量达1 630 mg /L,因此光合异养生长明显促进藻细胞的生长.     

三角褐指藻和小球藻营养成分的对比分析

通过检测三角褐指藻和小球藻的蛋白质、糖、色素、游离氨基酸及不饱和脂肪酸的含量,比较了三角褐指藻和小球藻的营养价值.结果发现:在单个细胞中,三角褐指藻的蛋白质、糖、叶绿素a、类胡萝卜素、游离氨基酸的含量高于小球藻;在1个生长周期(12,d)中,三角褐指藻累积的蛋白质、糖、游离氨基酸、棕榈油酸、二十碳五烯酸(EPA)也高于同龄的小球藻,但叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、油酸、亚油酸、亚麻酸及二十碳烯酸的累积量却低于小球藻.综合分析,三角褐指藻的营养价值不比小球藻低,具有潜在的开发前景.     

超声波对三角褐指藻脂肪酸组成的效应研究

研究了超声波对三角褐指藻脂肪酸组成的影响,在三角褐指藻整个生长期中每隔１２ｈ对其培养液进行超声辐射,结果表明,在较短超声作用时间下不饱和脂肪酸,占总脂肪酸的百分比有明显的增加,尤其是Ｃ１８：３百分含量得到大幅度的提高。     

快速高通量测定三角褐指藻油脂含量

为了实现三角褐指藻细胞内油脂含量的快速高通量测定,探索了尼罗红荧光染色法检测其油脂含量的检测条件.采用96孔板并配合酶标仪考察三角褐指藻的预处理液的种类及其用量、染色液尼罗红的用量、染色温度、染色时间以及细胞浓度对荧光强度的影响,确立最优染色条件,并研究荧光强度与油脂含量之间的对应关系.结果表明,TritonX-100终浓度为0.05%时,通透效果最佳,每100μL藻悬液中加3μL尼罗红染液(0.1mg/mL),温度40℃,时间10min,细胞浓度低于3×106个/mL时,荧光强度(y)与油脂含量(x)之间呈现良好的线性关系:y=927.37x+15.913,R2=0.9247.方法优化后,90min即内可完成对96个样品的处理及分析,极大提高了分析的通量.     

同源重组敲除三角褐指藻基因的研究

为探索应用基因敲除技术研究三角褐指藻基因功能的研究体系,本文以三角褐指藻甘油激酶基因作为靶基因,构建了同源重组基因敲除载体,利用微弹轰击法将该载体成功转化至三角褐指藻中,经100μg/mL Zeocin筛选和PCR验证获得了34个阳性转基因藻株;并进一步对三角褐指藻甘油激酶基因敲除转基因藻株的甘油激酶表达量和生长两方面进行分析,结果显示胞外甘油兼养不影响转基因藻细胞生长,甘油激酶不表达或表达量降低.本文通过构建敲除载体,完成了遗传转化,筛选获得阳性转基因藻,并进一步研究了转基因藻的性状,最终建立了应用同源重组基因敲除技术靶向研究三角褐指藻基因功能的研究体系.     

猪粪废水用于三角褐指藻培养的研究

研究了以猪粪废水培养一株三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的可行性.结果表明:猪粪废水经30g/L盐水适当稀释后可直接用于三角褐指藻的培养,无需添加其他营养物质.在污水稀释率为25倍时,藻细胞可良好地生长,最高密度为合成培养基的1.52倍.同时三角褐指藻有效去除了污水中的氮磷,总氮、氨氮和总磷的去除率分别为23%,93%和93%.与合成培养基养殖的藻相比,猪粪废水养殖的三角褐指藻的二十碳五烯酸和多不饱和脂肪酸的含量略有上升,实现了培养三角褐指藻转化废水为生物量并积累多不饱和脂肪酸的资源化.     

低温胁迫对三角褐指藻生长和生理生化特性的影响

在温度分别为3、6、9、20℃的条件下培养三角褐指藻,测定其细胞密度、生物量、叶绿素a含量、脯氨酸含量、丙二醛含量在3、6、9、12、15 d和可溶性糖含量随时间的动态变化情况.结果表明:在不同的低温胁迫条件下,三角褐指藻的细胞密度和生物量均明显低于对照组;叶绿素a含量处理前3d有所上升,没有明显低于对照组,处理6d后明显下降;脯氨酸含量、丙二醛含量、可溶性糖含量均有显著上升.该研究结果为进一步揭示三角揭指藻对逆境耐受能力的生理机制提供一定的理论依据.     

RNA干扰PEPC对三角褐指藻油脂含量的影响

本文应用生物信息学和RT-PCR方法分别获得了三角褐指藻两个PEPC全长cDNA,分别称为:PtPEPC1和PtPEPC2,前者完整开放阅读框3030bp,编码1009个氨基酸,后者完整开放阅读框2634bp,编码877个氨基酸;基于克隆所得PtPEPC的ORF构建了反向互补RNA干扰载体pPha-PtPEPC1RNAi和pPha-PtPEPC2RNAi,并用轰击法(PDS-1000/He)转化野生型三角褐指藻,筛选鉴定到了所需的阳性转基因藻;实时定量RT-PCR结果揭示:含PtPEPC RNA干扰结构的转基因藻的PEPCase基因的表达水平比野生型三角褐指藻该酶的表达水平有显著降低;野生型藻和转基因藻的油脂含量定量分析结果揭示:含RNAi干扰结构的转基因三角褐指藻油脂含量也明显高于野生型三角褐指藻,油脂增幅达2%~12%.     

强光下一氧化氮对三角褐指藻EPA产量的影响

二十碳五烯酸(EPA)是一种长链多不饱和脂肪酸,具有重要的医药价值.本文研究了光照强度和亚硝基铁氰化钠(SNP)分解产生的NO对三角褐指藻EPA产量的影响及机理.采用氧电极法探究光照强度与三角褐指藻光合速率的关系,结果显示三角褐指藻的光饱和点为126.3μmol/(m2·s).采用气相色谱法检测EPA的含量,结果显示外源NO可通过促进强光下三角褐指藻的快速生长来提高强光下三角褐指藻EPA的产量,而对单位生物量中EPA含量并没有影响;用血球计数板法检测三角褐指藻的生长速率,结果显示在光强200μmol/(m2·s)时三角褐指藻出现了光抑制,而SNP能解除这种抑制.探究NO促进三角褐指藻快速生长的机理,结果显示NO提高了乙醇酸氧化酶(GO)的活性.用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测外源NO对GO基因表达量的影响,结果显示GO的两个同工酶GOX和GLY的基因表达量均增强了.采用AMCA开关法对纯化的GO进行S–亚硝基化鉴定,结果显示GOX和GLY均发生了S–亚硝基化修饰.分别采用ISNO-AAPair、GPS-SNO和ISNO-Pse AAC方法预测S–亚硝基化位点,结果显示GLY的238位、GOX的237位和332位很可能是NO的修饰位点.因此,NO提高GO活性的途径有两条:提高GO基因的表达量;对GO酶蛋白进行S–亚硝基化修饰.综上所述,NO通过提高GO活性促进强光下三角褐指藻的快速生长从而提高三角褐指藻EPA的产量.     

甘油激酶基因对三角褐指藻理化性质的影响

为了探索甘油激酶(glycerol kinase,GK)基因对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)生长的影响,以GK基因过表达藻株、干扰藻株和野生型藻株为研究对象,测定了其生长情况、GK基因转录水平、GK活性、脂质含量和金藻昆布多糖等参数.结果显示:转基因藻株的比生长速率与野生型藻株无显著差异;过表达藻株GKOE1-8、GKOE7-1的转录水平显著上调,GK活性增强了3.55倍和2.58倍,中性油脂含量增加64.95%和18.49%,金藻昆布多糖含量增加50.89%和42.11%;而干扰藻株GKRNAi3-1、GKRNAi4-1的转录水平则显著下调,伴随着GK活性降低52.34%和6.64%,中性油脂含量减少26.88%和16.98%,金藻昆布多糖含量减少16.99%和10.62%.研究结果表明:在三角褐指藻中,过表达甘油激酶基因可以促进中性油脂和金藻昆布多糖等生物活性物质的积累,这为通过基因工程的手段获得产油率高的转基因藻株提供了参考.     

三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）形态及其变异现象的研究

分别对青岛、浙江、上海和厦门四地的三角褐指藻藻种类及单个细胞克隆后多个藻株的形态及其变异现象进行了比较研究。青岛、上海藻种短期培养后，培养液细胞基本由梭形细胞组成；浙江和厦门藻种则基本由三出放射形细胞组成。正常培养液中卵形细胞比例均在0．1％以下。特定条件下，梭形和三出放射形细胞均能产生卵形细胞，卵形细胞也能发育成梭形或三出放射形细胞；三出放射形细胞可能经“突变”或“定向变异”转变成梭形细胞，而梭形细胞培养液中没有出现三出放射形细胞。培养液比重、温度及光照条件的改变短期内对细胞形态类型的转变没有明显影响；淡水和低温（4℃－8℃）的长期胁迫能使梭形和三出放射形藻株发生高比例的卵形细胞。     

三角褐指藻PPDK基因RNAi载体的构建和基因枪转化

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的全基因组序列已经公布,为了把RNAi的技术应用于三角褐指藻的相关研究中,以C4途径关键酶丙酮酸磷酸二激酶基因(PPDK)为试验对象,构建了用于表达与PPDK部分序列同源的发夹RNA(hpRNA)的载体pPPDKi,并用基因枪方法成功将PPDKi和Zeocin抗性基因sh ble共转化到三角褐指藻细胞中.摸索出的较优基因枪转化的条件为:使用50%海水f/2培养基预培养的藻进行微粒轰击,轰击压力10.5 MPa,钨粉直径1.0 μm,轰击距离6.5 cm.PCR 检测结果表明,在Zeocin筛选的阳性藻株中约有60%同时整合了PPDKi序列.将其中6株共转化的转基因藻与野生型藻的生长速率进行比较,发现它们的生长受到4.6%～10.7%的抑制.这可能是PPDKi的表达影响了丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)的活性,从而进一步影响了三角褐指藻的生长,但也有可能是外源片段的插入影响了其他基因的正常表达,导致细胞活动异常.     

过表达甘油激酶三角褐指藻藻株富集油脂的研究

为了得到高产并符合生物柴油标准的微藻油脂的藻株,本文研究了在外源甘油存在的情况下野生型（WT）三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）,甘油激酶过表达藻株（GKOE）以及甘油激酶RNA干扰藻株（GKRNi）在添加浓度为20 mmol/L外源甘油的培养基中的生长情况、油脂产量以及脂肪酸组成.结果显示：（1）甘油兼养的GKOE藻细胞浓度可达到2.23×107个/mL,明显高于甘油兼养的WT的1.79×107个/mL和GKRNi的1.78×107 个/mL;（2）甘油兼养的GKOE油脂含量可达到31.73%,比甘油兼养的WT和GKRNi分别高了27.20%和26.63%;（3）尼罗红染色显示甘油兼养的GKOE荧光强度比甘油兼养的WT和GKRNi分别高16.26%和17.83%;（4）甘油兼养的GKOE总脂肪酸产量可达到0.052 mg/mL,比甘油兼养的WT和GKRNi高了36.84%和10.64%,说明其油脂适合于生物柴油开发.