重组人表皮生长因子在毕赤酵母中的表达纯化及鉴定

构建并筛选出重组人表皮生长因子(rhEGF)高表达的毕赤酵母(Pichia pastoris)基因工程菌株,于30L发酵罐进行中试发酵按1∶15接种15LFBSM发酵,pH 6.0、28~30℃、DO20%~30%、流加甲醇诱导发酵42h,rhEGF的表达量可达1g/L.采用疏水层析、离子交换柱层析及分子筛凝胶层析的方法分离纯化rhEGF,获得的rhEGF试制品的纯度大于95%,得率在40%以上.通过基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)测定rhEGF的分子质量为5 946.309u,与理论分子质量一致.N端蛋白序列分析仪分析其N端氨基酸序列,测序结果与理论的氨基酸序列一致.采用Balb/c 3T3细胞增殖/MTT比色法测定其活性,测定rhEGF的活性为1.0×106 IU/mg,与WHO标准品相当.本研究实现了毕赤酵母高效表达rhEGF并纯化得到符合《中国药典》标准的rhEGF,为工业化生产rhEGF提供基础.     

重组人尿激酶原的工业化制备与性质研究

将含有 pET2 9a prouk重组质粒的人尿激酶原工程菌经 10L种子罐培养及 10 0L发酵 ,IPTG诱导表达 ,其表达量为占菌体总蛋白的 2 0 % ,表达产物经体外变复性 ,CM 纤维素离子交换层析 ,Superdex 75分子筛层析及Affi preppolymyxinsupport亲和层析去热源 ,每 10 0L发酵液得重组人尿激酶原纯品 6g ,纯度达 95 %以上 ,比活大于 1.2× 10 4 IU /mg ,双链含量低于0 .5 % ,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准 .其分子量 (质谱测定 )、氨基酸组成、N、C 端氨基酸序列分析等均与理论值相符 .进行了等电点及肽图等性质研究     

制备附载rhTGF-β1的PLGA缓释支架及其对MSCs细胞形态的影响

为探讨自制的附载转化生长因子-β1(rhTGF-β1)的D,L-乳酸-CO-乙醇酸(PLGA)体外缓释生物支架对人骨髓间充质干细胞(MSCs)细胞形态的影响,制备了附载rhTGF-β1的PLGA生物支架,并检测了在PLGA的降解过程中rhTGF-β1的释药规律;同时分离培养人骨髓间充质干细胞,体外培养后分别接种于附载和未附载rhTGF-β1的PLGA支架上.通过扫描电镜观察不同时间段MSC在支架上的生长情况,实验结果表明,rhTGF-β1能被包裹进PLGA支架中,而且可在PLGA支架降解过程中持续释放出来.通过扫描电镜还观察到实验组支架上细胞呈多角或梭形,且有较多基质分泌,而对照组细胞较少.因此附载转化生长因子-β1的PLGA复合载体是一种较为理想的新型生物支架.     

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的工业化制备与性质研究

将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵,IPTG诱导表达,其表达量为占菌体总蛋白的20％,表达产物经体外变复性、TI—Sepharose亲和层析、SP-Sepharose离子交换层析,每100L发酵液得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)纯品4g,纯度达95％以上,比活大于500000IU／mg,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准．其分子量(质谱测定)、氨基酸组成、N、C-端氨基酸序列分析等均与理论值相符．同时进行了等电点测定及肽图分析等性质研究．     

猪繁殖和呼吸综合征病毒福建毒株ORF5的序列分析及原核表达

根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(p1/p2),用RT-PCR扩增PRRSV福建毒株FJ-1的全长糖基化囊膜蛋白基因(ORF5),将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,筛选阳性重组质粒进行序列测定与分析.再设计另一条引物(p3)与p2从重组载体pUCm-T-ORF5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的tGP5的编码序列tORF5,克隆入表达载体pGEX-4T-3后在大肠杆菌中表达.结果表明,FJ-1毒株ORF5基因为603 bp,编码200个氨基酸,与北美型参考毒株VR-2332、CH-1a及欧洲型参考毒株LV的氨基酸同源性分别为87%、89%和53%,推定福建毒株FJ-1属于北美型毒株.原核表达产物经过SDS-PAGE及Western Blot分析,证实为GP5与谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白.分子量为41 kDa.表达量约占菌体蛋白的15%,主要以包涵体形式存在.     

GHRP-scu-PA-32K突变体的构建、表达及纯化产物的部分性质研究

在scu-PA-32K的cDNA分子基础上经定点突变,在N端紧接Leu¹之前引入编码GHRP四肽的寡核苷酸序列(GGTCATAGGCCT),构建了GHRP-scu-PA-32K的突变体cDNA。将它克隆到表达载体pCM-βneo中,与pCMβ-dhfr共转染CHO/DHFR-细胞。筛选到的稳定表达株在无血清培养基的表达量为580IU/(106细胞·24h)。经锌离子螯合亲和柱纯化的产物,SDS-PAGE显示为单一蛋白条带,分子量为33kD,质谱法测定分子量也为33kD。经血纤维蛋白平板法测定比活为150000IU/mg蛋白。对血纤维蛋白的亲和性,突变体为scu-PA-32K的4.5倍。     

天蚕素A-蜂毒素杂合肽基因表达载体的构建及其分泌表达

根据天蚕素A(cecropin A,CA)N端第1-8个氨基酸残基和蜂毒素(melittin,ME)N端第1-18个氨基酸残基,用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的杂合肽CA(1-8)ME(1-18)基因.DNA序列分析表明,合成的基因与设计的一致.该基因插入毕赤氏酵母整合型质粒pPIC9K中,置于AOX I启动子的控制下,并通过电转化将重组质粒pPIC9K-came导入Pichiapastoris SMD1168宿主菌,在含有G418的YEPD平板上筛选整合型的多拷贝的转化子,转化子在BMMY培养基中经甲醇诱导表达,发现Tricine-SDS-PAGE有明显条带.比浊法初步测定表明,表达产物came对E.coli DH5α具有抗菌活性.     

鸡Tgfβ1干扰表达载体的构建及在MDCC-MSB1细胞中的干扰表达

构建鸡转化生长因子 β1(Tgfβ1)干扰表达载体,在马立克病毒转化的肿瘤细胞系(MDCC-MSB1)中鉴定其抑制表达效果.根据GenBank中鸡Tgfβ1序列以及pG1.2载体序列,设计合成3条干扰鸡Tgfβ1表达的短发夹核糖核酸(shRNA)干扰序列,分别将其插入表达载体pG1.2,构建pG1.2-Tgfβ1干扰表...     

鱼腥藻铁调蛋白基因(alr0957)表达和Fe~(3+)对藻生长的影响

根据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 FurC基因(alr0957)序列信息设计特异性引物,用降落PCR法从染色体DNA中扩增得约450 bp目的片段.运用TA克隆将其连接到pMD18-T载体上,经筛选测序获得阳性重组质粒.再经过双酶切、纯化FurC基因,连接原核表达载体pET-28a(+),并转化表达菌株BL21和IPTG诱导表达.经测序鉴定的阳性菌株中的FurC,运用SDS-PAGE检测重组蛋白,并利用镍柱层析法纯化目的蛋白.由藻细胞密度、叶绿素a含量、可溶性糖含量等改变探讨不同Fe3+浓度对藻类生长的影响.结果表明:在37℃经1 mmol/L IPTG诱导18 h,成功表达了分子量约为19000的融合蛋白.小于0.5mg/L Fe3+促进藻生长,大于0.9 mg/L Fe3+抑制藻生长,最适藻生长Fe3+浓度为0.5⁰.9 mg/L.     

赖氨酰内切酶在大肠杆菌中的重组表达、复性及纯化

首先在产酶溶杆菌来源的赖氨酰内切酶（Lys-C）成熟肽序列的N端和C端分别融合人工前肽(MGSK)和6×His标签，将密码子优化后的序列插入表达载体pET-28a；其次以IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导型启动子PT7控制Lys-C的高效表达，并针对重组菌株JM109DE3＿PT7-LysC开展生物反应器高密度发酵生产Lys-C；再次收集和溶解包涵体得到Lys-C变性液，通过Sephadex G25层析脱除DTT（二硫苏糖醇），并在Lys-C复性液中添加前导肽(pre-N-pro)辅助成熟肽蛋白折叠；进一步通过切向流过滤、Ni NTA-Sepharose亲和层析和Sephacryl S-100层析等一系列纯化步骤，获得高纯度的重组Lys-C；最后进行酶切三肽底物和门冬胰岛素前体检测，分析重组Lys-C的活性水平。结果表明：重组Lys-C的发酵产量为2.4 g/L，经复性和纯化后的终产量可达48 mg/L；添加80 mg/L pre-N-pro促进了重组Lys-C的复性，复性后酶活相比于未添加pre-N-pro时提升了4.8倍，最高可达到13.8 U/L；经过多步纯化后，重组Lys-C的...     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及原核表达

克隆、表达和纯化禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为筛选与NS1相互作用的宿主蛋白以及深入研究NS1蛋白的功能打下基础.根据GenBank中收录的H5N1亚型禽流感病毒NS1基因序列,设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增AIV NS1基因,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-28a载体上,经酶切分析及序列测定正确后,鉴定出NS1基因的阳性重组子.阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,通过Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对NS1蛋白进行纯化.结果成功克隆H5N1亚型AIV的NSl基因,其核苷酸序列长度为678 bp,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,表达产物在上清及包涵体中均有表达.经纯化,目的蛋白纯度高达90%,成功表达纯化出28KD的NS1融合蛋白并鉴定其免疫学活性.成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为进一步研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.     

肠道病毒71型SHZH03株VP1基因在毕赤酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增得到肠道病毒71型(EV71SHZH03)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒VP1/pPIC9K,转化Pichia pastoris 酵母宿主菌Gs115,以Myc-Tag多克隆抗体作为一抗,利用双层滤膜法筛选酵母转化子.甲醇诱导表达.SDS-PAGE分析显示:表达产物的分子量约为30000,与天然VP1大小一致,ELISA实验表明,表达上清液可与EV71患者急性感染期血清呈阳性反应,表明重组蛋白VP1具有免疫原性.     

人转化生长因子β1在大肠杆菌RR1中的表达及产物纯化

目的：构建能高效表达人转化生长因子β1的基因工程菌,优化产物分离纯化的条件,方法：用PCR方法扩增人转化生长因子β1的cDNA,将该cDNA片段插入经改造的pBV220表达载体pBL2的表达框架中,构建了表达菌株RR1／pBL－2－TGF－β1．42℃温控诱导表达,采用谷胱甘肽法,对重组蛋白进行复性。通过阳性离子交换、变性分子筛层析纯化重组蛋白,用MTT法测定重组蛋白的活性。结果：所构建的表达菌株,其TGF－β1的表达量约为15％,重组蛋白的复性率达到30％,经纯化获得了银染一条带的重组蛋白,测活表明和理级具有较强的生物活性。结论：人转化生长因子β1在大肠杆菌RR1中实现了高效表达,获得了具有生物活性的重组TGF－β1。     

牛泡沫病毒跨膜蛋白的穿膜区具有细胞毒性作用

泡沫病毒(FV)具有广泛的宿主范围,可以感染从人到鱼几乎所有脊椎动物细胞,可见其包膜蛋白具有极强的膜融合能力.分析牛泡沫病毒(BFV)的跨膜蛋白(TM),在其C端存在一个穿膜螺旋区,其中含有连续的疏水氨基酸.本文以BFV3026原病毒DNA为模板,利用PCR分段扩增TM编码区,克隆原核表达载体pET32a( ),序列分析证实后,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导,仅有穿膜区完全缺失的TM3获得表达,其余含有完整或部分穿膜区的TM1及TM2均未表达.表达菌生长状态测定显示:TM穿膜区C端疏水氨基酸串联区对细胞具有强烈致死效应.同时利用金属螯合层析对所表达TM3蛋白进行初步纯化,Westernblot证实其有良好的抗原性.     

人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达

目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化.方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列.以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达.表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽.结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量最高,约占菌体蛋白总量的30%.Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带.重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽.结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白.     

人载脂蛋白基因apoAⅠ在毕赤氏酵母中的表达

将化学法合成的apoAⅠ基因插入分泌型载体 pPIC9K .将重组的 pPIC9K apoAⅠ用BglⅡ酶切后 ,转化PichiapastorisGS115菌株 ,筛选获得G4 18高抗性转化子 .转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导 ,上清液用SDS PAGE检测 ,有明显的rApoAⅠ表达 .经Phenyl sepharose 6 (FastFlow)疏水层析柱和SephadexG 5 0 (coarse)分子筛层析 ,得到rApoAⅠ蛋白纯品 .经Westernblotting ,N末端氨基酸顺序测定证明 ,毕赤氏酵母表达的rApoAⅠ与人血浆提取的ApoAⅠ基本一致 .     

人源化IGF-Ⅰ基因的人工合成、重组与表达

为了实现人源化胰岛素样生长因子Ⅰ(human insulin-like growth factors-Ⅰ,hIGF-Ⅰ)基因在大肠杆菌中的高效表达,了解IGF-Ⅰ基因结构与功能的关系,探索人工制备的hIGF-Ⅰ在临床治疗疾病上的应用,实验参照GenBank中人IGF-Ⅰ氨基酸序列并进行密码子优化,然后人工合成这条基因并将克隆至pUC57载体上.构建重组表达载体pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ,转化大肠杆菌BL21菌株,进行不同诱导条件的优化,SDS-PAGE电泳确定最佳诱导条件,并利用建立hIGF-Ⅰ的间接ELISA检测方法分析表达产物活性.结果表明,获得重组表达载体pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ,并在大肠杆菌中实现与GST蛋白的融合可溶性表达.最佳诱导条件OD600值为0.8、IPTG浓度为0.5 mmol/L,表达蛋白的浓度为2.811 mg/mL,且产物具有抗原活性.说明人工制备的hIGF-Ⅰ与天然的hIGF-Ⅰ生物活性有部分相同,在基础研究和药物开发方面可作为替代物进行研究.     

重组抑肽酶的表达纯化和活性测定

抑肽酶是一种用途广泛的丝氨酸蛋白酶抑制剂.用基因重组技术将化学合成的抑肽酶基因插入表达载体pET28a,并转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导后,表达产物以包涵体形式存在于菌体内包涵体纯化后经复性及CM-阳离子交换层析后,从每升培养液可获得2.4 mg抑肽酶,纯度可达90%.活性测定结果显示,重组抑肽酶可竞争性抑制纤溶酶对小分子底物S2251的水解活性.抑制常数(Ki)为(0.6±0.3)nmol/L,与天然抑肽酶的抑制活性相似.     

野生革耳菌漆酶cDNA在巴斯德毕赤酵母中的表达

将分离到的野生革耳菌(Panusrudis)漆酶的cDNA序列克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建成受强启动子AOX1控制的重组表达载体.重组质粒DNA经BglII线性化后,电击转化毕赤酵母GS115细胞,通过G418筛选和PCR鉴定的重组酵母在甲醇诱导后能分泌表达活性漆酶.低温培养是该漆酶基因活性表达的必要条件.培养基中添加400μmol/L的CuSO4最有利于漆酶的活性表达.