秀丽隐杆线虫胆固醇7,8-脱氢酶在大肠杆菌中的表达

胆固醇7,8–脱氢酶是参与胆固醇代谢的还原酶,可以将胆固醇转化为7–脱氢胆固醇(合成维生素D3的重要中间体).合成秀丽隐杆线虫的胆固醇7,8-脱氢酶基因daf-36,与具有T7强启动子的载体pET32a(+)连接后,成功构建pET32a-daf-36表达质粒,转入大肠杆菌表达系统E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta(DE3),经过IPTG诱导培养,蛋白质电泳图谱及质谱结果表明此酶得到了高效表达.     

重组鸡IL-18与新城疫HN基因融合蛋白在毕赤酵母中表达条件的优化

为探索ChMIL18-HN在毕赤酵母中最适宜的表达条件,采用小型摇瓶培养系统,通过对重组毕赤酵母菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在不同诱导时间、培养液pH值、甲醇诱导剂剂量及培养温度的条件下表达目的蛋白的分析,以对其表达条件进行优化。结果表明:重组菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在pH6.5,甲醇诱导浓度为1.5%,培养诱导温度为30℃的条件下诱导156h,目的蛋白的表达量最高。     

RACK1蛋白在毕赤酵母GS115中的表达研究

本文克隆得到了拟南芥和水稻的活化态C激酶1受体基因,AtRACK1/OsRACK1,用电转化的方法成功将AtRACK1/OsRACK1基因整合到毕赤酵母GS115的染色体上,经菌体培养和甲醇诱导后获得了有效分泌表达,表达产物存在于培养液上清中,表达蛋白经SDS-PAGE鉴定显示其分子量为36kD左右,在诱导72小时后AtRACK1/OsRACK1蛋白表达量最大,该结果为进一步纯化RACK1蛋白,获得植物RACK1蛋白抗体奠定了基础.     

密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定.     

毕赤酵母密码子用法对人骨形成蛋白6表达的影响分析

对已筛选出的毕赤酵母阳性转化子菌株（His＋Mut＋）和（His＋Muts）进行PCR验证,用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组骨形成蛋白6的表达情况,为了解释无表达的结果,对酵母的密码子与重组骨形成蛋白6的密码子兼容性进行了理论上的初步分析。     

基于GFP-nanobody的纯化酵母表达RIIIJ-GFP蛋白研究

采用大肠杆菌重组表达GFP-nanobody后,将其与琼脂糖凝胶偶联,对酵母菌分泌表达RIIIJ-GFP蛋白纯化. 荧光显微镜下观察到绿色荧光凝胶珠,SDS-PAGE检测GFP-nanotrap纯化的蛋白条带单一,且胶上可直接观察到GFP绿色荧光. 表明大肠杆菌表达的GFP-nanobody具有生物活性,可高效结合RIIIJ-GFP,这为RIIIJ蛋白功能的研究奠定基础.     

外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略

高效表达外源蛋白, 在理论和实践上特别是在生物制药中具有重要意义, 巴氏毕赤酵母( Pichia pastoris) 是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.影响外源蛋白在 P. pastoris中表达的因素很多, 主要包括外源基因自身的特性、载体、宿主细胞几个方面,了解和灵活运用它们的联系,有助于获得外源基因在 P. pastoris 中的高效表达.     

利用转基因毕赤酵母高表达小分子药用多肽的研究

天然小肽Gsp有明显的降血糖功效,由59个氨基酸残基组成.其编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9-Gsp. 经电穿孔将该质粒转化为毕赤酵母GS115(His4- mut+),挑选His+ muts型菌株进行重组蛋白胞外表达研究.表达蛋白经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析确定了相对分子质量的正确性,其氨基酸测序显示与天然多肽序列一致,并经紫外扫描分析确定了表达量为344mg/L左右.     

黑曲霉外切葡聚糖酶基因密码子的优化及表达

通过NCBI(美国国立生物技术信息中心)对黑曲霉的来源外切葡聚糖酶基因(cbh1)的氨基酸序列进行分析,发现其16个活性部位中有6个位点附近的氨基酸为毕赤酵母(Pichia pasto-ris)表达的稀有密码子。利用反向长距离PCR技术将这些活性位点附近的稀有密码子定点突变为毕赤酵母表达偏爱密码子。将优化后的表达载体pPICZαA-cbh1m转入毕赤酵母KM71H菌株中进行诱导表达。经密码子优化后的cbh1m基因较未优化前cbh1基因的表达量提高了17%。     

兔防御素基因酵母表达的研究

防御素是由动植物体内产生的一种多肽类抗菌、抗病毒活性物质,本研究根据巴斯德毕赤 酵母偏爱密码子的特性,设计兔防御素NP2基因,并构建巴斯德毕赤酵母的表达质粒pGAPZα-NP2,通 过LiCl法转入巴斯德毕赤酵母中,筛选和检测结果表明,兔防御素NP2基因已经成功地转入巴斯德毕 赤酵母,并得到表达。该实验可为兔防御素NP2抗菌抗病毒的研究和开发奠定理论和物质基础。     

毕赤酵母表达猪胃蛋白酶的研究

利用已有的猪胃蛋白酶原A cDNA,构建毕赤酵母pPIC3．5K—pA胞内表达载体．经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得2株高表达的重组子,并研究了在不同pH、不同诱导时间、不同起始浓度和甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低．结果表明：在pH7、诱导72h、起始诱导浓度为OD600为2、甲醇诱导浓度为1％时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6．46U／mL．     

毕赤酵母分泌表达嵌合HEV表位的HBcAg颗粒

在毕赤酵母分泌表达嵌合有HEV受体相关表位12A10的HBcAg蛋白,经甲醇诱导后的培养液上清通过切向流浓缩、更换缓冲液后,进行疏水层析纯化.CsCl等密度梯度离心测得分泌的重组颗粒的密度为1.32 g/mL.透射电镜观察显示,纯化的重组颗粒为均一的直径30 nm左右的空心颗粒.小鼠免疫实验表明,纯化颗粒免疫8周后鼠血清中的特异性12A10抗体滴度可达到1.6×105,并且重组颗粒较好地呈递了HEV受体相关的非免疫优势表位.本文的结果为毕赤酵母胞外分泌表达其它大尺度的重组蛋白颗粒提供了参考,为研究携带表位多肽的疫苗载体提供了范例.     

家蝇防御素defensin cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

提取家蝇总RNA,RT-PCR扩增编码家蝇防御素defensin的cDNA,克隆并测定了其序列,将该cDNA序列与酵母表达载体pPICZαA重组,构建酵母分泌型表达载体pPICZα-de,电激法转化毕赤酵母(Pichia pasto-ris)受体菌GS115。经表型筛选和PCR鉴定证明目的片段已稳定整合到酵母染色体基因组中。在含不同浓度的Zeoc in平板上筛选到高拷贝整合的转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达,用Tric ine-SDS-PAGE确定了表达产物的正确性,琼脂孔穴平板扩散法、比浊法测定了表达产物的活性,对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有一定的杀菌活性。     

重组人骨形态发生蛋白4在毕赤酵母中的表达研究

试图建立人骨形态发生蛋白-4在毕赤酵母(Pichia pastoris) 中的表达技术.包括:将hBMP4成熟片段从全长cDNA亚克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上,构建能表达rhBMP4的载体质粒pPIC9K-hBmp4.经转化Pichia pastoris宿主菌株GS115,PCR鉴定基因整合后,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达上清液经SDS-PAGE和Western-blot 分析,结果表明rhBMP4以单体形式分泌到发酵上清液中,单体分子质量大小约为26 ku,摇瓶表达量达到20.13 μg/mL.     

不同启动子调控的两种半纤维素酶分泌表达的比较

为提高耐热木聚糖酶DSB和耐热甘露聚糖酶ManB在毕赤酵母GS115中分泌表达的酶活力,选择了3个调控蛋白表达能力较强的启动子P_(FLD1),P_(GAP)和P_(TEF1),以P_(AOX1)为参照,分别在毕赤酵母GS115中进行分泌表达.摇瓶发酵结果表明:P_(FLD1),P_(TEF1),P_(GAP)和P_(AOX1)能有效介导DSB和ManB的分泌,但其胞外酶活相差较大.对于DSB,使用P_(AOX1)时酶活力明显高于P_(FLD1),P_(TEF1)和P_(GAP),最高酶活达846 U/mL;对于ManB,使用P_(FLD1)时酶活力高于P_(AOX1),最高酶活达222 U/mL.故在GS115中分泌表达DSB时选用P_(AOX1),而分泌表达ManB时选用P_(FLD1).     

胞内表达猪生长激素基因的重组酵母菌构建与鉴定

将猪生长激素(pGH)cDNA定向插入毕赤酵母胞内表达载体pPIC 3.5k质粒,重组构建了pPIC 3.5kpGH/GS115酵母表达系统, 其表达产物的SDSPAGE和Western blot结果表明, pGH蛋白在胞内获得正确表达,表达量达378 mg/L.     

环状排列黄色荧光蛋白在大肠杆菌及毕赤酵母中表达的比较研究

采用基因工程方法,实现了cpYFP在毕赤酵母X33的表达,并与大肠杆菌BL21(DE3)表达做对比.结果表明,毕赤酵母胞外分泌的目的蛋白不仅背景较大肠杆菌表达的清晰,且荧光强度为前者的3倍.同时,毕赤酵母表达的重组cpYFP对超氧阴离子自由基反应的灵敏性高于大肠杆菌表达的cpYFP.这些结果表明,毕赤酵母表达体系可作为制备重组cpYFP的良好体系,也为cpYFP在自由基生物学领域的广泛应用提供充足的原料来源.     

一种自剪切内含肽重组酿酒酵母表达优化研究

自剪切内含肽纯化系统在大肠杆菌中已经得到很好的应用。为了在真核生物中应用该系统,以酿酒酵母为宿主,p HR质粒为表达载体,构建微型内含肽ΔI-CM intein酿酒酵母表达系统。以猪免疫球蛋白Ig G的Fc domain为亲和标签,绿色荧光蛋白gfp为报告蛋白,在酿酒酵母GPD强启动子作用下,表达出融合的Fc-intein-gfp蛋白。检测发现融合序列在起始密码子ATG前加入一段Kozak序列有利于gfp表达。在此基础上,将微型内含肽ΔI-CM intein序列替换成密码子优化的ΔI-CMintein-O序列,显著促进gfp蛋白的表达量,初步实现了ΔI-CM intein融合蛋白的高效表达。为新型自剪切内含肽酿酒酵母表达系统的建立和重组蛋白高效纯化的实现奠定了基础。     

毕赤酵母△~9-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ9-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR,获得一个741 bp的毕赤酵母cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得该cDNA的3′和5′序列,从而得到全长为1 689 bp的cDNA序列.序列分析结果表明,该序列具有一个长度为1 194 b p、编码397个氨基酸的开放阅读框(PPD9).与报道的Δ9-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构,在其氨基酸序列的C-末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区.该序列为一个新的编码Δ9-脂肪酸脱氢酶的基因,为了验证其功能,把开放阅读框序列PPD9亚克隆到表达载体pYES 2.0,构建重组表达载体pYPPD9,并转化到酿酒酵母的Δ9-脂肪酸脱氢酶缺陷型菌株DTY-11A中进行表达。通过平板互补实验结果表明,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的蛋白具有Δ9-脂肪酸脱氢酶活性,能弥补DTY-11A中由于Δ9-脂肪酸脱氢酶的缺失而引起的致死性突变。     

SOD-肝素结合结构域融合蛋白的毕赤酵母重组菌株构建及表达

利用基因工程技术将人源Cu, Zn-SOD与EC-SOD的C末端肝素结合结构域（HBD）的编码序列进行密码子优化并人工合成,然后电转化至毕赤酵母进行表达.单因素实验表明,与现有研究的一些重组EC-SOD相比,其比活力提高了1.30～3.78倍.正交分析得最佳摇瓶条件为诱导时间为5 d,初始pH值为5.2,诱导剂量的体积分数为1.0%,酶活可达1 120.2 U?mL^-1,是初始酶活的2.94倍;这些结果表明,SOD-HBD融合蛋白在一定程度上解决了重组EC-SOD表达量低的问题,为重组EC-SOD蛋白的推广与应用提供重要的物质基础条件.