六种核酸提取试剂盒对粪样中小鼠肝炎病毒核酸 提取效率的比较

目的 比较六种商品化试剂盒在小鼠粪便中提取小鼠肝炎病毒(MHV)RNA的效率,筛选出效率高、耗时短的核酸提取方法。方法 采集感染MHV小鼠的新鲜粪便样本,分别用液氮研磨法、磁珠匀浆法以及PBS溶解离心法进行处理,通过同一核酸提取试剂盒比较病毒核酸提取效率,明确最佳样本前处理方法;之后,用6种试剂盒进行RNA提取,经反转录后进行TaqMan实时定量PCR检测,以Ct值评价6种试剂盒的提取效率,结合产物测序和血清抗体ELISA结果,筛选MHV的最佳核酸提取方法。结果 对于粪便样本的前处理,液氮研磨法的RNA提取效率显著高于磁珠匀浆法。对于6种试剂盒的提取效果,TIANGEN DP422[总RNA浓度：(549.70±52.38) ng/μL,Ct值：(24.51±0.10)]核酸提取效率最高;TIANGEN SD101[总RNA浓度：(274.13±6.87) ng/μL,Ct值：(2.39±0.017)]和QIAGEN 52904[总RNA浓度：(288.13±15.11) ng/μL,Ct值：(2.40±0.012)]用时最短;XS VRL[总RNA浓度：(348.80±15.85) ng/μL,Ct值：(24.70±0.13)]操作最为方便。结论 粪便样本前处理建议采用液氮研磨法。针对粪便中MHV RNA的提取,TIANGEN DP422提取效率最高,推荐用于小鼠肝炎病毒的分子生物学检测。     

基于小鼠肝炎病毒研究遗传工程小鼠隔离检疫设计

目的以小鼠肝炎病毒(MHV)为例,研究两种常用小鼠感染MHV后粪便中病毒核酸检测量与血清特异性抗体的变化,探讨实验动物病原微生物感染的检测设计。方法用MHV病毒核酸检测阳性的脏垫料持续饲养C57BL/6和BALB/c小鼠(n=20) 28 d,进行脏垫料接触感染。之后所有小鼠使用无菌垫料进行单笼饲养,每周收集新鲜粪便和血清样本,经Taqman荧光定量PCR(qPCR)和ELISA法检测后进行统计分析。结果对于BALB/c小鼠,采用qPCR法检测时,在实验第21天即有阳性检出(阳性率20%),第28天阳性检出率达到最高,为80%,第42天阳性检出率为50%,至第56天无阳性检出。血清ELISA检测发现,实验第42天才有MHV特异性抗体检出(阳性率为50%)。对于C57BL/6小鼠,采用qPCR法检测时,在第28天和第42天分别从20%小鼠粪便中检出MHV。而采用ELISA法在整个实验期均未检出特异性阳性抗体。结论在隔离检疫和常规病原检测中,建议选用BALB/c小鼠作为哨兵鼠,替代C57BL/6小鼠。由于qPCR法具有早检出和更高检出率的优点,建议在隔离检疫早期采用基于分子生物学的粪样核酸检测法替代ELISA法。     

两种国产与一种进口小鼠肝炎病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较研究

目的 本研究拟对比小鼠肝炎病毒(MHV)抗体ELISA检测试剂盒的敏感性、特异性、精密性和可信度,以筛选出既经济又可靠的检测试剂盒.方法 选择两种国产与一种进口的ELISA试剂盒检测MHV抗体和以下5种病毒阳性血清:小鼠仙台病毒(SV)、小鼠肺炎病毒(PVM)、小鼠细小病毒(MVM)、小鼠鼠痘病毒(MPV)及小鼠呼肠孤...     

不同小鼠肝炎病毒对ELISA方法检测其血清抗体的影响

目的 建立小鼠肝炎病毒（Mouse Hepatitis Virus,MHV）血清抗体ELISA检测方法,用于本地区MHV的日常监测,以便对SPF小鼠感染状况及时作出判断。方法 选取3种MHV毒株MHV1、MHV-JHM和MHV-A59,通过L929细胞扩增培养获得纯化浓缩抗原并筛选适合包被抗原类型;免疫BALB/C小鼠,获得高效价免疫阳性血清;优化ELISA反应体系建立规范化的ELISA试剂盒并用于临床小鼠血清样品的检测。结果 筛选出适合本地区的MHV包被抗原类型为MHV1,建立了病毒扩增及浓缩纯化方法,制备的MHV抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为标准化质控血清。包被抗原、待检血清和酶结合物最佳工作浓度分别为4. 0μg/m L (10 -7. 73 /0. 1 m L TCID50)、1∶40和1∶4 000稀释;批次内和批次间平均变异系数分别为5. 13%和5. 57%;检测灵敏度为1∶4 000稀释;与小鼠仙台病毒（SV）、小鼠肺炎病毒（PVM）、呼肠孤病毒III型（Reo3）、小鼠细小病毒（MVM）和鼠痘病毒（Ect）阳性血清均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于10%。对165份血清样品进行检测,阳性血清相符率97. 37%（37/38）,阴性血清相符率92. 19%（118/127）。结论 本研究建立的ELISA方法检测小鼠血清MHV抗体具有较高的特异性、敏感性和结果可重复性,可以用于本地区MHV日常病原学监测,以便对小鼠感染状况作出准确判断。     

小鼠巨细胞病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立小鼠巨细胞病毒(Mouse Cytomegalovirus,MCMV)荧光定量PCR方法并对其进行初步应用。方法 选取NCBI发表的MCMV Smith株DNA polymerase基因保守序列设计引物探针,建立MCMV的荧光定量PCR方法,对方法的特异性、敏感性、重复性及稳定性进行验证,并应用该方法检测掺入MCMV的小鼠血液样品及2018年度送检的409份小鼠血液样本。结果 建立的MCMV荧光定量PCR方法标准曲线Slope为-3. 418,R2值为0. 999,扩增效率为96. 137%,可定量检测到的MCMV最低含量为47 copies/μL。以大鼠巨细胞病毒,猴巨细胞病毒,人单纯疱疹病毒,伪狂犬病毒及猫疱疹病毒I型为模板均无扩增曲线,特异性良好。方法组内和组间变异系数分别为0. 39%～0. 68%和0. 48%～1. 01%,重复性和稳定性好。可检测到掺入小鼠血液样品中MCMV病毒的最大稀释度为1∶1000(100. 75 TCID50/0. 1 m L),409份小鼠血液样品经检测均为阴性。结论 建立的小鼠巨细胞病毒荧光定量PCR方法有很好的敏感性、特异性及稳定性,可有效地检测小鼠中MCMV,为实验小鼠MCMV的监测及相关标准的补充完善提供了技术参考。     

一株鸭病毒性肝炎病毒的RT-PCR鉴定

提取送检鸭的病肝组织RNA,做RT-PCR,获得了一条长391bp的片段,序列分析表明,与DHV-I基因组5′端的非编码区(371~758)序列片段相似性约在96.4%~96.9%间,提示有DHV-I感染。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

根据Barrett发表的犬瘟热病毒 (CDV)Onderstepoort弱毒株融合蛋白 (F)基因序列 ,设计合成了一对寡聚核苷酸引物 ,并以南京农业大学惠赠的Onderstepoort标准株反转录产物为模板 ,建立了CDV的RT PCR方法 ,并应用于CDV的诊断。结果表明 ,以该对引物 ,只能从CDV ONP标准株反转录产物中扩增出大小为 32 4bp的核苷酸片段 ,与理论设计值大小一致 ,而正常Vero细胞和同为副粘病毒科的新城疫病毒 (NDV)作为对照 ,病毒扩增结果为阴性。RT PCR可检出 1μl作 10 6倍稀释的CDV ONP标准株反转录产物 ,说明其具有很高的敏感性。应用试验结果 ,可从感染CDV犬的组织病料中提取RNA ,反转录产物中也扩增出 32 4bp的核苷酸片段。通过本研究不仅建立了敏感性、特异性好的CDV的RT PCR检测方法 ,也为F基因的克隆和序列测定及表达奠定了基础。     

小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用

摘要: 目的建立小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 方法,并初步应用于实验小鼠中。方法根据NCBI 上发表的MVM( NC_001510) 基因组序列,设计引物和探针,建立MVM 荧光定量PCR 方法。考察引物探针的最佳线形范围,特异性及灵敏度,并使用该方法对178 份清洁级小鼠粪便DNA 样本进行检测。结果MVM 荧光定量PCR 方法最佳线性范围为109 ～ 104 拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2 值可达0. 99,灵敏度为101 拷贝/μL,特异性强,与大鼠细小病毒H-1 株和KRV 株、猪细小病毒均无交叉反应。应用荧光定量PCR 方法对178 份小鼠粪便DNA进行检测,结果均为阴性。结论建立的MVM 荧光定量PCR 方法具有特异、灵敏的特点,为MVM 的流行病学调查、检测提供了有效的技术支持。     

近交系BALB／c小鼠繁殖与保种方法的建立和应用

在保种繁殖过程中，采用修饰平行线系统保种法对近交系ＢＡＬＢ／ｃ小鼠进行严格兄妹交配繁殖，保持完整的谱系记录，控制饲养环境条件，成功地建立了ＢＡＬＢ／ｃ小鼠基础群及血缘扩大群，广泛提供科学研究试验应用。     

丙型肝炎病毒抗体免疫酶快速检测试剂的评价

对丙型肝炎病毒抗体免疫酶快速检测试剂(IEA)检测丙型肝炎病毒抗体(HCV-Ab)的性能、结果等技术参数进行评价,为实验室的选用提供参考.采用IEA法、ELISA法和胶体金法对中国生物制品检定所“第三代ELISAHCV-Ab诊断试剂国家参考品”和3297份血清或血浆标本同时测定,对IEA的敏感性、特异性、重复性和检测时间等结果进行评价.结果表明:IEA可通过中国生物制品检定所“第三代ELISAHCV-Ab诊断试剂国家参考品”检验;与ELISA法比较,IEA的检出率为99.06%,灵敏度与ELISA相当,胶体金的检出率为86.01%,灵敏度比ELISA低;IEA检测所需时间15～25min.IEA既有ELISA的敏感性、特异性,又有胶体金简便、快速的特点.适用于献血员及高危人群中HCV抗体的筛查和临床诊断HCV感染,以及门诊、急诊和基层医疗单位的现场检测.     

艾滋病病毒的核酸检测法

被称为“世纪瘟疫”的艾滋病是获得性免疫缺陷综合症（AIDS）的简称,人类免疫缺陷病毒（HIV）是引起艾滋病的病原体。本文综述了艾滋病的血清学检测方法,尤其对现在普遍采用的三种先进的核酸检测方法PCR、bDNA和NASBA方法的检测原理进行了比较详细的介绍。     

反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究

目的:建立起简单、快速、灵敏、准确的慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药位点的反向线性探针(reverse line probe,RLP)检测方法.方法:根据HBV野生及耐药基因序列设计通用探针、3'、5'对称加有poly-C的特异性探针和5'标记生物素的扩增引物.将探针线性固定在硝酸纤维膜上,使HBV PCR扩增产物与探针进行杂交.通过优化杂交条件,建立RLP检测方法.利用该方法对重庆地区86个慢性乙肝病人进行检测,同时与直接测序结果比较.结果:半巢式PCR可对103拷贝/ml的血清样本进行有效特异扩增,新建的RLP检测方法可对PCR扩增产物在1 ng/ml以上,或血清样本中突变型DNA占野生型DNA比例为5％以上的均可有效检测,86例临床的检测灵敏度为100％,野生型和耐药型的检测准确性分别为98.09％(103/105)、100％ (43/43),与直接测序法比,RLP检测野生与耐药混合型准确性更好.结论:反向线性探针杂交检测方法检测HBV拉米夫定耐药位点方便、灵敏、准确,是HBV拉米夫定治疗有效的监控工具,该方法适合临床应用.     

禽流感病毒三种检测方法的比较研究

对分别应用病毒分离鉴定、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、间接免疫荧光(IFA)3种方法对病料组织中的禽流感病毒(AIV) 进行检测与比较研究。结果显示:经鸡胚尿囊腔接种分离到的病毒,通过用禽流感病毒H5、H9亚型单克隆抗体所进行的血凝(HA)和血凝抑制试验(HI),鉴定为AIV H5亚型毒株;应用RT-PCR技术直接对病料组织抽提的RNA样品进行检测,从病料组织能扩增出大小为229bp的AIV通用目的片段和大小为380bp的H5亚型特异性片段;取病料组织的过滤液接种狗肾上皮细胞(MDCK)单层,24h后用H5亚型AIV特异性的单克隆抗体进行间接免疫荧光试验,结果在细胞核、细胞质内观察到特异性的荧光。研究的结果表明,3种技术都可对病料样品中的AIV进行检测,而RT-PCR和IFA两种方法还可直接对病料样品中的病毒进行亚型的鉴定。相对而言,后两者具有更快速、更敏感、操作更简便的特点。     

甲肝病毒单克隆抗体的研制与应用

本研究成功制备了抗甲肝病毒 (HAV)McAb ,为甲肝研究和诊断提供了大量高效价标准化抗体 .用细胞培养的NJ 3株HAV免疫Balb/c小鼠 ,经细胞融合技术、IFA筛选和有限稀释克隆 ,建立了 5株能稳定分泌抗HAVMcAb的杂交瘤细胞 .经鉴定 ,其上清和腹水的抗体效价分别为 0 5× 10 2 ～ 1× 10 3及 1× 10 3～ 2× 10 5.用免疫印迹法和间接ELISA分析 ,这 5株抗体分别能与HAV的 3个抗原位点结合 .在HAAg检测中 ,McAb的应用简化了操作步骤     

猴副流感病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为对易感动物以及相关生物材料和生物制品进行猴副流感病毒(SV5)的快速病原检测,根据SV5病毒SH基因序列,设计了1对引物,建立了检测SV5的RT-PCR方法,通过优化确定了RT-PCR体系的最佳工作条件。核酸序列分析显示,所扩增片段与GenBank数据库中报道的SV5病毒株WR-21005序列同源性达到97%,证明该方法特异。敏感性分析显示,该方法可检测的最小RNA浓度为2.1 ng/μL,能检出的最小病毒滴度为3.98CCID50/0.1 mL。初步将该方法运用于猴、地鼠、常用传代细胞和猴源生物制品的检测,在所检测的样品中均未检出猴副流感病毒核酸序列。结果表明,所建立的RT-PCR方法可用于猴副流感病毒(SV5)的诊断和分子流行病学调查。     

猫细小病毒 PCR 检测方法的建立及初步应用

摘要: 目的 建立猫细小病毒 PCR 检测方法,应用于猫临床样本中 FPV 的快速检测。方法 根据已发表的 FPV VP2 基因序列设计合成引物,并以此建立 FPV 的 PCR 检测方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证。 用建立的方法对 33 份猫临床样品进行检测。结果 建立的 FPV PCR 检测方法与猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)、猫冠 状病毒(FeCV)、猫合胞体病毒(FeSFV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为 5lgTCID50 / mL,相应的 DNA 模板浓度为 4. 9 × 102 拷贝/μL;FPV DNA 在 － 30℃冰箱放置 12 个月仍可检测出目的条带。应用 该方法从 33 份猫临床样本中检测出 21 份 FPV 核酸阳性。结论 建立的 FPV PCR 检测方法具有特异、敏感及稳定 的特点,适合于临床 FPV 的感染检测。